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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
le voir, le phénomène de fixation d’un ligand peut être décrit par une équation qui a
une forme similaire à celle de l’équation de MICHAELIS et MENTEN, alors que la
fixation sur plusieurs sites indépendants peut être représentée par une équation qui
a la même forme que l’équation cinétique pour un mélange d’enzymes catalysant la
même réaction. Bien qu’un traitement exhaustif de la fixation de ligands ne fasse
pas partie des objectifs de cet ouvrage, nous présentons brièvement le traitement de
ces systèmes parce que les expériences de fixation complémentent souvent les
mesures cinétiques dans l’étude de systèmes enzymatiques. La ressemblance entre
les équations de fixation et les équations de vitesse des systèmes enzymatiques,
nous amène également à discuter de l’utilisation du graphique de SCATCHARD,
notamment en raison de l’abondance d’erreurs associées avec l’utilisation de ce
type de graphique.
En pratique, la fixation d’un ligand est souvent mesurée par dialyse à l’équilibre,
une expérience qui consiste à établir un équilibre à travers une membrane semi-perméable (perméable au ligand mais pas à la protéine), et à mesurer la concentration
de ligand de part et d’autre de cette membrane. Une fois l’équilibre atteint, si nous
supposons que la concentration de ligand libre, [] L libre , est identique de chaque
côté de la membrane et qu’elle peut être mesurée directement dans le compartiment
qui ne contient pas de protéine, la concentration de ligand fixé à la protéine peut
alors être déterminée en soustrayant la valeur connue de [] L libre de la concentration totale de ligand mesurée dans le compartiment contenant la protéine. A ce
stade, il est essentiel de prendre conscience d’une caractéristique essentielle des
mesures de dialyse à l’équilibre. Dans une expérience de cinétique à l’état stationnaire, c’est l’activité cinétique de l’enzyme qui est mesurée, et à condition que
l’activité spécifique de cette enzyme soit suffisamment élevée, une concentration
faible d’enzyme peut être utilisée sans affecter la précision de la mesure. Inversement, dans une expérience de dialyse à l’équilibre, la quantité mesurée, [] L fixé ,
ne peut jamais dépasser la concentration totale des sites de fixation et est obtenue
par soustraction ; il est important dès lors de s’assurer que la concentration de la
macromolécule est du même ordre de grandeur que la concentration du ligand.
Puisque les expériences de dialyse à l’équilibre et celles de cinétique dans des
conditions d’état stationnaire sont réalisées dans des conditions différentes, elles
peuvent dans certains cas conduire à des résultats apparemment inconsistants, si
par exemple l’enzyme s’associe à de hautes concentrations.
S’il existe un seul type de site de fixation de L sur E, le phénomène de fixation peut
être représenté par le modèle suivant :
K
E + n L
EL n
[3.60]
Dans ce modèle, K représente la constante individuelle de dissociation du ligand L
pour chaque site de fixation et n représente le nombre de sites de fixation :
K
EL
EL
libre
=
[] []
[]
[3.61]
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
le voir, le phénomène de fixation d’un ligand peut être décrit par une équation qui a
une forme similaire à celle de l’équation de MICHAELIS et MENTEN, alors que la
fixation sur plusieurs sites indépendants peut être représentée par une équation qui
a la même forme que l’équation cinétique pour un mélange d’enzymes catalysant la
même réaction. Bien qu’un traitement exhaustif de la fixation de ligands ne fasse
pas partie des objectifs de cet ouvrage, nous présentons brièvement le traitement de
ces systèmes parce que les expériences de fixation complémentent souvent les
mesures cinétiques dans l’étude de systèmes enzymatiques. La ressemblance entre
les équations de fixation et les équations de vitesse des systèmes enzymatiques,
nous amène également à discuter de l’utilisation du graphique de SCATCHARD,
notamment en raison de l’abondance d’erreurs associées avec l’utilisation de ce
type de graphique.
En pratique, la fixation d’un ligand est souvent mesurée par dialyse à l’équilibre,
une expérience qui consiste à établir un équilibre à travers une membrane semi-perméable (perméable au ligand mais pas à la protéine), et à mesurer la concentration
de ligand de part et d’autre de cette membrane. Une fois l’équilibre atteint, si nous
supposons que la concentration de ligand libre, [] L libre , est identique de chaque
côté de la membrane et qu’elle peut être mesurée directement dans le compartiment
qui ne contient pas de protéine, la concentration de ligand fixé à la protéine peut
alors être déterminée en soustrayant la valeur connue de [] L libre de la concentration totale de ligand mesurée dans le compartiment contenant la protéine. A ce
stade, il est essentiel de prendre conscience d’une caractéristique essentielle des
mesures de dialyse à l’équilibre. Dans une expérience de cinétique à l’état stationnaire, c’est l’activité cinétique de l’enzyme qui est mesurée, et à condition que
l’activité spécifique de cette enzyme soit suffisamment élevée, une concentration
faible d’enzyme peut être utilisée sans affecter la précision de la mesure. Inversement, dans une expérience de dialyse à l’équilibre, la quantité mesurée, [] L fixé ,
ne peut jamais dépasser la concentration totale des sites de fixation et est obtenue
par soustraction ; il est important dès lors de s’assurer que la concentration de la
macromolécule est du même ordre de grandeur que la concentration du ligand.
Puisque les expériences de dialyse à l’équilibre et celles de cinétique dans des
conditions d’état stationnaire sont réalisées dans des conditions différentes, elles
peuvent dans certains cas conduire à des résultats apparemment inconsistants, si
par exemple l’enzyme s’associe à de hautes concentrations.
S’il existe un seul type de site de fixation de L sur E, le phénomène de fixation peut
être représenté par le modèle suivant :
K
E + n L
EL n
[3.60]
Dans ce modèle, K représente la constante individuelle de dissociation du ligand L
pour chaque site de fixation et n représente le nombre de sites de fixation :
K
EL
EL
libre
=
[] []
[]
[3.61]