11 – LES RÉACTIONS RAPIDES
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centre 4Fe-4S. Pour résoudre cette question, la vitesse d'hydrolyse a du être mesurée directement, et cela a été réalisé en mesurant la production du phosphate inorganique par la méthode de quenched-flow. Cette approche a permis de déterminer
que la réaction d'hydrolyse proprement dite a une constante de vitesse de 44 ± 4 ms
(figure 11.7b), qui n'est pas distinguable de la valeur mesurée par la méthode de
stopped-flow, confirmant que les deux réactions sont synchrones.
Temps
E 420nm
0,02
20ms
Temps (ms)
Phosphate libéré
(nmol)
0
200
150
100
50
0
8
4
b - "Quenched flow"
a - "Stopped flow"
11.7 - Comparaison des données de stopped-flow et de quenched-flow pour la réaction
catalysée par la nitrogénase de Klebsiella pneumoniae (EADY, LOWE et THORNELEY, 1978)
La trace de stopped-flow (a) mesure le transfert d'électrons entre les deux composants de
la nitrogénase, alors que les observations de quenched-flow (b) mesurent la vitesse
d'apparition du phosphate inorganique, c'est-à-dire l'hydrolyse de l'ATP. L'égalité des
constantes de temps montrent que les deux processus sont couplés.
Dans les premières versions de la méthode de quenched-flow, le temps entre le
mélange et l'arrêt était modifié en modifiant l'organisation physique de l'appareil,
c'est-à-dire en modifiant la vitesse de flux et la longueur du tube séparant les deux
systèmes de mélange. En pratique, cela imposait des limitations sévères sur les
échelles de temps qui pouvaient être utilisées et la méthode n'était pas pratique
pour un usage général. De nombreux problèmes ont été résolus par la méthode de
quenched-flow pulsé, qui a été décrite par FERSHT et JAKES (1975). Dans cet
arrangement, la réaction est initiée exactement comme dans une expérience de
stopped-flow, et un deuxième ensemble de seringues est utilisé pour l'arrêt. Cellesci sont mises en mouvement automatiquement un laps de temps préétabli après le
premier mélange. La période entre le mélange et l'arrêt est contrôlé électroniquement et ne dépend pas des dimensions physiques de l'appareil. Puisqu'il ne
nécessite pas l'utilisation de longs tubes, ce système est plus économique en terme
de réactif que le système de quenched-flow développé originellement.
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centre 4Fe-4S. Pour résoudre cette question, la vitesse d'hydrolyse a du être mesurée directement, et cela a été réalisé en mesurant la production du phosphate inorganique par la méthode de quenched-flow. Cette approche a permis de déterminer
que la réaction d'hydrolyse proprement dite a une constante de vitesse de 44 ± 4 ms
(figure 11.7b), qui n'est pas distinguable de la valeur mesurée par la méthode de
stopped-flow, confirmant que les deux réactions sont synchrones.
Temps
E 420nm
0,02
20ms
Temps (ms)
Phosphate libéré
(nmol)
0
200
150
100
50
0
8
4
b - "Quenched flow"
a - "Stopped flow"
11.7 - Comparaison des données de stopped-flow et de quenched-flow pour la réaction
catalysée par la nitrogénase de Klebsiella pneumoniae (EADY, LOWE et THORNELEY, 1978)
La trace de stopped-flow (a) mesure le transfert d'électrons entre les deux composants de
la nitrogénase, alors que les observations de quenched-flow (b) mesurent la vitesse
d'apparition du phosphate inorganique, c'est-à-dire l'hydrolyse de l'ATP. L'égalité des
constantes de temps montrent que les deux processus sont couplés.
Dans les premières versions de la méthode de quenched-flow, le temps entre le
mélange et l'arrêt était modifié en modifiant l'organisation physique de l'appareil,
c'est-à-dire en modifiant la vitesse de flux et la longueur du tube séparant les deux
systèmes de mélange. En pratique, cela imposait des limitations sévères sur les
échelles de temps qui pouvaient être utilisées et la méthode n'était pas pratique
pour un usage général. De nombreux problèmes ont été résolus par la méthode de
quenched-flow pulsé, qui a été décrite par FERSHT et JAKES (1975). Dans cet
arrangement, la réaction est initiée exactement comme dans une expérience de
stopped-flow, et un deuxième ensemble de seringues est utilisé pour l'arrêt. Cellesci sont mises en mouvement automatiquement un laps de temps préétabli après le
premier mélange. La période entre le mélange et l'arrêt est contrôlé électroniquement et ne dépend pas des dimensions physiques de l'appareil. Puisqu'il ne
nécessite pas l'utilisation de longs tubes, ce système est plus économique en terme
de réactif que le système de quenched-flow développé originellement.