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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
Une information plus détaillée concernant les méthodes de flux peut être obtenue
dans les ouvrages plus spécialisés, (par exemple, HIROMI (1979)). Des méthodes
plus élaborées comprennent l'utilisation de spectrophotomètres à balayage rapide
décrite par HOLLAWAY et WHITE (1975). Ce dernier type d'instrument, maintenant
disponible commercialement, offre des avantages considérables sur les types plus
simples d'équipement de stopped-flow, puisque des spectres complets peuvent être
enregistrés au cours de la phase transitoire. Ceci a permis, par exemple, une étude
détaillée des intermédiaires produits durant la réaction de la myéloperoxydase avec
le peroxide d'hydrogène (MARQUEZ, HUANG et DUNFORD, 1994).
11.3.5. Les méthodes de relaxation
Le mélange de réactifs ne peut pas être réalisé efficacement en moins de 0,2 ms, et
l'arrêt du flux dans un instrument nécessite environ 0,5 ms. (Bien qu'il soit concevable d'arrêter une réaction plus abruptement, en pratique, cela provoquerait des
ondes de choc qui généreraient des fluctuations transitoires dans le système de
détection). Le quenching, soit chimique, soit par refroidissement, prend également
un temps fini. Il existe donc une limite d'environ 0,5 ms pour le temps mort qu'il
est possible d'atteindre avec les méthodes de flux et il est peu probable qu'une
adaptation des instruments permettra une réduction notable de ce temps. En conséquence les processus qui sont terminés en moins de 0,5 ms ne peuvent être observés
au moyen de ces méthodes de flux. Ceci constitue une restriction sévère pour un
enzymologiste car la plupart des réactions catalysées par des enzymes impliquent
de tels processus, et ils en existent quelques-uns pour lesquels le cycle catalytique
complet se déroule en moins de 1 ms. FERSHT (1999), par exemple, a répertorié sept
enzymes dont les constantes catalytiques sont de l'ordre de 10
3 s
–1 ou supérieures.
Des considérations de ce type ont conduit au développement des méthodes de
relaxation (EIGEN, 1954) pour l'étude des processus très rapides. Ces méthodes ne
nécessitent pas le mélange de réactifs, mais comme nous le décrirons ci-dessous, il
peut être utile de les combiner avec une méthode de stopped-flow. Dans une méthode standard de relaxation, un système à l'équilibre est soumis à une perturbation
qui modifie la constante d'équilibre et nous observons alors l'évolution du système
vers un nouvel équilibre, un processus qui est appelé relaxation. Plusieurs méthodes
de relaxation existent, parmi lesquelles la plus familière est certainement la
méthode de saut de température (t-jump) dans laquelle la perturbation est une
augmentation de température réalisée par passage d'une décharge de courant
électrique à travers l'échantillon : de cette manière il est possible d'augmenter la
température de l'échantillon de 10°C en environ 1 μs. Plus récemment des techniques de saut de température utilisant un pulse de radiation émis par un laser ont
été développées. Ces méthodes permettent d'augmenter la température en moins
d'1 ns. Un autre type de perturbation consiste dans un saut de pression : cette
méthode est utilisée pour mesurer des variations de volume qui peuvent avoir lieu
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
Une information plus détaillée concernant les méthodes de flux peut être obtenue
dans les ouvrages plus spécialisés, (par exemple, HIROMI (1979)). Des méthodes
plus élaborées comprennent l'utilisation de spectrophotomètres à balayage rapide
décrite par HOLLAWAY et WHITE (1975). Ce dernier type d'instrument, maintenant
disponible commercialement, offre des avantages considérables sur les types plus
simples d'équipement de stopped-flow, puisque des spectres complets peuvent être
enregistrés au cours de la phase transitoire. Ceci a permis, par exemple, une étude
détaillée des intermédiaires produits durant la réaction de la myéloperoxydase avec
le peroxide d'hydrogène (MARQUEZ, HUANG et DUNFORD, 1994).
11.3.5. Les méthodes de relaxation
Le mélange de réactifs ne peut pas être réalisé efficacement en moins de 0,2 ms, et
l'arrêt du flux dans un instrument nécessite environ 0,5 ms. (Bien qu'il soit concevable d'arrêter une réaction plus abruptement, en pratique, cela provoquerait des
ondes de choc qui généreraient des fluctuations transitoires dans le système de
détection). Le quenching, soit chimique, soit par refroidissement, prend également
un temps fini. Il existe donc une limite d'environ 0,5 ms pour le temps mort qu'il
est possible d'atteindre avec les méthodes de flux et il est peu probable qu'une
adaptation des instruments permettra une réduction notable de ce temps. En conséquence les processus qui sont terminés en moins de 0,5 ms ne peuvent être observés
au moyen de ces méthodes de flux. Ceci constitue une restriction sévère pour un
enzymologiste car la plupart des réactions catalysées par des enzymes impliquent
de tels processus, et ils en existent quelques-uns pour lesquels le cycle catalytique
complet se déroule en moins de 1 ms. FERSHT (1999), par exemple, a répertorié sept
enzymes dont les constantes catalytiques sont de l'ordre de 10
3 s
–1 ou supérieures.
Des considérations de ce type ont conduit au développement des méthodes de
relaxation (EIGEN, 1954) pour l'étude des processus très rapides. Ces méthodes ne
nécessitent pas le mélange de réactifs, mais comme nous le décrirons ci-dessous, il
peut être utile de les combiner avec une méthode de stopped-flow. Dans une méthode standard de relaxation, un système à l'équilibre est soumis à une perturbation
qui modifie la constante d'équilibre et nous observons alors l'évolution du système
vers un nouvel équilibre, un processus qui est appelé relaxation. Plusieurs méthodes
de relaxation existent, parmi lesquelles la plus familière est certainement la
méthode de saut de température (t-jump) dans laquelle la perturbation est une
augmentation de température réalisée par passage d'une décharge de courant
électrique à travers l'échantillon : de cette manière il est possible d'augmenter la
température de l'échantillon de 10°C en environ 1 μs. Plus récemment des techniques de saut de température utilisant un pulse de radiation émis par un laser ont
été développées. Ces méthodes permettent d'augmenter la température en moins
d'1 ns. Un autre type de perturbation consiste dans un saut de pression : cette
méthode est utilisée pour mesurer des variations de volume qui peuvent avoir lieu