11 – LES RÉACTIONS RAPIDES
377
La réaction est initiée en poussant simultanément les pistons des deux seringues,
provoquant ainsi le mélange des deux réactifs et forçant le mélange à se déplacer à
travers la chambre d'observation jusque dans la seringue d'arrêt. Un court déplacement du piston de cette seringue d'arrêt l'amène jusqu'à une butée mécanique qui
l'empêche de se déplacer plus loin, qui empêche ainsi le mélange de se poursuivre
et qui déclenche simultanément le système de détection et d'enregistrement. Le
temps qui se passe inévitablement entre le mélange des réactifs et son arrivée dans
la chambre d'observation est de l'ordre de la milliseconde et est appelé le temps
mort de l'appareil.
Moteur
ou
pression
Chambre
de mélange
Déchets
Cellule
d'observation
Substrat
Enzyme
Remplissage
Remplissage
Source de
lumière
Système de
détection
Arrêt
Déclencheur
11.5 - Représentation d'un appareil de stopped-flow
Dans sa forme courante, la méthode de stopped-flow nécessite l'utilisation d'un
spectrophotomètre pour suivre le déroulement de la réaction. Cette méthode est
donc particulièrement utile pour étudier les réactions qui engendrent une large
variation de l'absorbance à une longueur d'onde utilisable, comme par exemple, les
réactions catalysées par les déshydrogénases dans lesquelles le NAD ox est réduit en
NAD red . Cette méthode n'est cependant pas limitée à de tels cas, puisque d'autres
systèmes de détection peuvent être utilisés. Par exemple, de nombreuses réactions
catalysées par des enzymes s'accompagnent de la libération ou de la fixation de
protons, qui peuvent être détectés optiquement en ajoutant un indicateur de pH
dans le mélange réactionnel, une approche qui remonte aux méthodes de flux
continu (BRINKMAN, MARGARIA et ROUGHTON, 1933). Dans d'autres cas, il est
possible d'utiliser des changements de fluorescence (HASTINGS et GIBSON, 1963)
ou de tout autre signal spectroscopique mesurable rapidement.
11.3.4. Le quenched flow
Quelques fois la nature chimique des événements observés par spectroscopie dans
la méthode de stopped-flow n'est pas clairement établie (PORTER, 1967). Ces ambiguïtés peuvent être levées en utilisant la méthode de quenched-flow (figure 11.6).
Dans cette méthode, la réaction est arrêtée (quenched) brièvement après le
377
La réaction est initiée en poussant simultanément les pistons des deux seringues,
provoquant ainsi le mélange des deux réactifs et forçant le mélange à se déplacer à
travers la chambre d'observation jusque dans la seringue d'arrêt. Un court déplacement du piston de cette seringue d'arrêt l'amène jusqu'à une butée mécanique qui
l'empêche de se déplacer plus loin, qui empêche ainsi le mélange de se poursuivre
et qui déclenche simultanément le système de détection et d'enregistrement. Le
temps qui se passe inévitablement entre le mélange des réactifs et son arrivée dans
la chambre d'observation est de l'ordre de la milliseconde et est appelé le temps
mort de l'appareil.
Moteur
ou
pression
Chambre
de mélange
Déchets
Cellule
d'observation
Substrat
Enzyme
Remplissage
Remplissage
Source de
lumière
Système de
détection
Arrêt
Déclencheur
11.5 - Représentation d'un appareil de stopped-flow
Dans sa forme courante, la méthode de stopped-flow nécessite l'utilisation d'un
spectrophotomètre pour suivre le déroulement de la réaction. Cette méthode est
donc particulièrement utile pour étudier les réactions qui engendrent une large
variation de l'absorbance à une longueur d'onde utilisable, comme par exemple, les
réactions catalysées par les déshydrogénases dans lesquelles le NAD ox est réduit en
NAD red . Cette méthode n'est cependant pas limitée à de tels cas, puisque d'autres
systèmes de détection peuvent être utilisés. Par exemple, de nombreuses réactions
catalysées par des enzymes s'accompagnent de la libération ou de la fixation de
protons, qui peuvent être détectés optiquement en ajoutant un indicateur de pH
dans le mélange réactionnel, une approche qui remonte aux méthodes de flux
continu (BRINKMAN, MARGARIA et ROUGHTON, 1933). Dans d'autres cas, il est
possible d'utiliser des changements de fluorescence (HASTINGS et GIBSON, 1963)
ou de tout autre signal spectroscopique mesurable rapidement.
11.3.4. Le quenched flow
Quelques fois la nature chimique des événements observés par spectroscopie dans
la méthode de stopped-flow n'est pas clairement établie (PORTER, 1967). Ces ambiguïtés peuvent être levées en utilisant la méthode de quenched-flow (figure 11.6).
Dans cette méthode, la réaction est arrêtée (quenched) brièvement après le