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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
l'histoire de la biochimie, et devraient être étudiées par tous les expérimentateurs
qu'ils s'intéressent ou non aux cinétiques de réaction, parce qu'elles illustrent
comment l'ingéniosité scientifique permet de surmonter des obstacles apparemment
infranchissables. Ces expériences ont été réalisées avant le développement commercial de systèmes automatiques de mesure de l'intensité lumineuse et l'équipement qui existait à l'époque, nécessitait plusieurs secondes d'ajustement manuel
pour réaliser chaque mesure. Alors qu'il pouvait sembler évident que les processus
se déroulant sur une échelle de temps de l'ordre de la milliseconde ne pouvaient pas
être étudiés avec un tel équipement, HARTRIDGE et ROUGHTON ont démontré le
contraire.
Après avoir été presque totalement abandonnée au profit des méthodes de stoppedflow dont nous allons discuter ci-dessous, et ce en grande partie à cause de la consommation importante de matériel, la méthode de flux continu a récemment connu
un regain d'utilisation avec le développement de méthodes de mélange ultra-rapide,
qui permettent de descendre sous la barre de la milliseconde. Comme nous l'avons
signalé, de nombreuses réactions ont des constantes de temps très courtes, inférieures à la milliseconde. Avec le développement des méthodes de mesure spectroscopique qui permettent aujourd'hui de réaliser un échantillonnage rapide, les
méthodes de flux restaient limitées par la capacité à mélanger rapidement et entièrement les deux solutions. Un premier système de mélange ultra-rapide, développé
en 1985 par REGENFUSS et ses collègues, repose sur la miniaturisation du système
et sur un astucieux système de mélange (REGENFUSS, 1985). Le développement de
ce système est presque passé inaperçu jusqu'à ce que ROUSSEAU et ses
collaborateurs développent un système proche pour étudier la fixation de l'O 2 sur la
cytochrome oxydase (TAKAHASHI, CHING, WANG et ROUSSEAU, 1995). Depuis ce
système a connu de nouveaux développements et des applications diverses (RODER
et SHASTRY, 1999).
11.3.3. Les méthodes de stopped-flow
De très nombreuses améliorations ont été apportées au système de mélange rapide
de HARTRIDGE et ROUGHTON par MILLIKAN (1936), CHANCE (1940, 1951),
GIBSON et MILNES (1964) et par d'autres, qui ont conduit au développement de la
méthode de stopped-flow, qui est devenue la méthode la plus couramment utilisée
pour étudier les réactions rapides. Cet appareil représenté schématiquement dans la
figure 11.5 est constitué :
de deux ou plusieurs seringues contenant les solutions de réactif,
d'un système de mélange,
d'une chambre d'observation,
d'une seringue ou d'une vanne d'arrêt,
d'un système de détection et d'enregistrement capable de répondre très rapidement.
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
l'histoire de la biochimie, et devraient être étudiées par tous les expérimentateurs
qu'ils s'intéressent ou non aux cinétiques de réaction, parce qu'elles illustrent
comment l'ingéniosité scientifique permet de surmonter des obstacles apparemment
infranchissables. Ces expériences ont été réalisées avant le développement commercial de systèmes automatiques de mesure de l'intensité lumineuse et l'équipement qui existait à l'époque, nécessitait plusieurs secondes d'ajustement manuel
pour réaliser chaque mesure. Alors qu'il pouvait sembler évident que les processus
se déroulant sur une échelle de temps de l'ordre de la milliseconde ne pouvaient pas
être étudiés avec un tel équipement, HARTRIDGE et ROUGHTON ont démontré le
contraire.
Après avoir été presque totalement abandonnée au profit des méthodes de stoppedflow dont nous allons discuter ci-dessous, et ce en grande partie à cause de la consommation importante de matériel, la méthode de flux continu a récemment connu
un regain d'utilisation avec le développement de méthodes de mélange ultra-rapide,
qui permettent de descendre sous la barre de la milliseconde. Comme nous l'avons
signalé, de nombreuses réactions ont des constantes de temps très courtes, inférieures à la milliseconde. Avec le développement des méthodes de mesure spectroscopique qui permettent aujourd'hui de réaliser un échantillonnage rapide, les
méthodes de flux restaient limitées par la capacité à mélanger rapidement et entièrement les deux solutions. Un premier système de mélange ultra-rapide, développé
en 1985 par REGENFUSS et ses collègues, repose sur la miniaturisation du système
et sur un astucieux système de mélange (REGENFUSS, 1985). Le développement de
ce système est presque passé inaperçu jusqu'à ce que ROUSSEAU et ses
collaborateurs développent un système proche pour étudier la fixation de l'O 2 sur la
cytochrome oxydase (TAKAHASHI, CHING, WANG et ROUSSEAU, 1995). Depuis ce
système a connu de nouveaux développements et des applications diverses (RODER
et SHASTRY, 1999).
11.3.3. Les méthodes de stopped-flow
De très nombreuses améliorations ont été apportées au système de mélange rapide
de HARTRIDGE et ROUGHTON par MILLIKAN (1936), CHANCE (1940, 1951),
GIBSON et MILNES (1964) et par d'autres, qui ont conduit au développement de la
méthode de stopped-flow, qui est devenue la méthode la plus couramment utilisée
pour étudier les réactions rapides. Cet appareil représenté schématiquement dans la
figure 11.5 est constitué :
de deux ou plusieurs seringues contenant les solutions de réactif,
d'un système de mélange,
d'une chambre d'observation,
d'une seringue ou d'une vanne d'arrêt,
d'un système de détection et d'enregistrement capable de répondre très rapidement.