11 – LES RÉACTIONS RAPIDES
375
Les méthodes de résonance magnétique, en particulier la résonance magnétique
nucléaire, sont de plus en plus utilisées pour étudier la structure des protéines et
peuvent également être appliquées à la mesure des constantes de vitesse des systèmes à l'équilibre, en particulier à celles des constantes de vitesse de dissociation
des ligands, par exemple des complexes enzyme-inhibiteur. L'échelle de temps
couverte correspond à celle des méthodes de saut de température.
11.3.2. Les méthodes de flux continu
Pour les processus qui ont des constantes de temps d'un ordre égal ou supérieur à la
milliseconde, les techniques principalement utilisées sont les méthodes de mélange
rapide collectivement désignées sous le nom de méthodes de flux. Elles sont toutes
dérivées de la méthode de flux continu mise au point par HARTRIDGE et
ROUGHTON (1923) pour mesurer la vitesse de la combinaison de l'oxygène avec
l'hémoglobine. Dans cette méthode la réaction était initiée en forçant deux réactifs
à se mélanger, l'hémoglobine réduite et un tampon oxygéné, de sorte que le
mélange était conduit à se déplacer rapidement dans un tube d'un mètre de long.
Dans une expérience de ce type, pour éviter un flux laminaire de composants
incomplètement mélangé dans le tube, il est essentiel d'inclure une chambre de
mélange dans le système et de créer une turbulence pour s'assurer d'un mélange
complet et instantané. Tant que la vitesse de flux est constante, le mélange observé
à un point quelconque du tube a un âge constant, déterminé par la vitesse de flux et
la distance qui sépare ce point de la chambre de mélange. Ainsi, en réalisant des
mesures à plusieurs points le long du tube, il est possible d'obtenir une courbe
d'avancement pour les premières étapes de la réaction.
Le principe de l'appareil est présenté dans la figure 11.4, qui n'est pas une représentation réaliste de l'appareil original, mais qui a été dessinée de manière à souligner la relation avec la méthode de stopped-flow dont nous discuterons ci-dessous.
Système de
détection
Moteur
ou
pression
Chambre
de mélange
Déchets
Tampon
oxygéné
Hémoglobine
désoxygénée
Source de
lumière
11.4 - Méthode de flux continu
En positionnant le système de détection à différentes positions le long de la chambre
d'observation, il est possible de visualiser des mélanges qui ont des ages différents. Cet
appareil nécessite de grandes quantités de protéines mais ne nécessite pas un système
de détection avec une réponse rapide.
La méthode de flux continu requiert de grandes quantités de matériel, ce qui a
initialement limité son utilisation à l'étude de l'hémoglobine. Néanmoins, les expériences d'HARTRIDGE et de ROUGHTON (1923) sont parmi les plus importantes dans
375
Les méthodes de résonance magnétique, en particulier la résonance magnétique
nucléaire, sont de plus en plus utilisées pour étudier la structure des protéines et
peuvent également être appliquées à la mesure des constantes de vitesse des systèmes à l'équilibre, en particulier à celles des constantes de vitesse de dissociation
des ligands, par exemple des complexes enzyme-inhibiteur. L'échelle de temps
couverte correspond à celle des méthodes de saut de température.
11.3.2. Les méthodes de flux continu
Pour les processus qui ont des constantes de temps d'un ordre égal ou supérieur à la
milliseconde, les techniques principalement utilisées sont les méthodes de mélange
rapide collectivement désignées sous le nom de méthodes de flux. Elles sont toutes
dérivées de la méthode de flux continu mise au point par HARTRIDGE et
ROUGHTON (1923) pour mesurer la vitesse de la combinaison de l'oxygène avec
l'hémoglobine. Dans cette méthode la réaction était initiée en forçant deux réactifs
à se mélanger, l'hémoglobine réduite et un tampon oxygéné, de sorte que le
mélange était conduit à se déplacer rapidement dans un tube d'un mètre de long.
Dans une expérience de ce type, pour éviter un flux laminaire de composants
incomplètement mélangé dans le tube, il est essentiel d'inclure une chambre de
mélange dans le système et de créer une turbulence pour s'assurer d'un mélange
complet et instantané. Tant que la vitesse de flux est constante, le mélange observé
à un point quelconque du tube a un âge constant, déterminé par la vitesse de flux et
la distance qui sépare ce point de la chambre de mélange. Ainsi, en réalisant des
mesures à plusieurs points le long du tube, il est possible d'obtenir une courbe
d'avancement pour les premières étapes de la réaction.
Le principe de l'appareil est présenté dans la figure 11.4, qui n'est pas une représentation réaliste de l'appareil original, mais qui a été dessinée de manière à souligner la relation avec la méthode de stopped-flow dont nous discuterons ci-dessous.
Système de
détection
Moteur
ou
pression
Chambre
de mélange
Déchets
Tampon
oxygéné
Hémoglobine
désoxygénée
Source de
lumière
11.4 - Méthode de flux continu
En positionnant le système de détection à différentes positions le long de la chambre
d'observation, il est possible de visualiser des mélanges qui ont des ages différents. Cet
appareil nécessite de grandes quantités de protéines mais ne nécessite pas un système
de détection avec une réponse rapide.
La méthode de flux continu requiert de grandes quantités de matériel, ce qui a
initialement limité son utilisation à l'étude de l'hémoglobine. Néanmoins, les expériences d'HARTRIDGE et de ROUGHTON (1923) sont parmi les plus importantes dans