7 – UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'ÉTUDE DES MÉCANISMES ENZYMATIQUES
243
Cette capacité qu'ont de nombreux enzymes de catalyser des réactions partielles,
implique que les expériences d'échange d'isotopes nécessitent des enzymes mieux
purifiés que les expériences conventionnelles pour que les résultats soient valables.
La raison de cette nécessité est simple. Supposons que nous étudions l'aspartate
transaminase, qui catalyse la réaction suivante (que nous avons présenté avec plus
de détails dans l'équation [6.3]).
Glutamate + Oxaloacétate
2-oxoglutarate + Asparate
[7.8]
La présence dans la préparation d'enzyme de faibles quantités d'enzymes contaminants comme par exemple d'autres transaminases, a peu d'importance si nous
suivons la réaction complète car il est improbable qu'un de ces contaminants soit
capable de catalyser la réaction complète. Toutefois, l'échange entre le glutamate et
le 2-oxoglutarate représente un autre problème, en particulier si nous utilisons une
méthode très sensible de dosage, et nous devons nous assurer qu'aucune autre
transaminase n'est présente si nous voulons obtenir des informations sur l'aspartate
transaminase. Bien que cet avertissement s'applique en particulier aux enzymes qui
opèrent par un mécanisme à enzyme modifié, il n'est pas inutile d'apporter une
même attention à la pureté de la préparation d'enzyme lors de l'étude d'autres
enzymes, même si ceux-ci ne sont pas susceptibles de catalyser des réactions partielles ; comme nous en avons discuté à la fin du § 6.2.3, il pourrait y avoir plus
d'enzymes qui réagissent selon un mécanisme à enzyme modifié que ce qui n'est
généralement accepté.
7.5. ECHANGE D'ISOTOPES HORS ÉQUILIBRE
7.5.1. Rapports de flux chimiques
Comme nous l'avons noté ci-dessus, les équations de vitesse pour l'échange d'isotopes deviennent très compliquées si la réaction non-marquée n'est pas maintenue à
l'équilibre durant l'échange. Néanmoins, il y a une bonne raison pour étudier des
réactions enzymatiques qui ne sont pas à l'équilibre. A l'équilibre chimique il est
impossible de démêler les effets dus à la fixation du substrat de ceux dus à la
libération du produit, et, sauf si l'enzyme est capable de catalyser une demi-réaction
(§ 7.4), nous sommes obligés de considérer la réaction entière. L'échange d'isotopes hors d'équilibre, par contre, permet d'isoler et d'examiner séparément la partie
d'un mécanisme qui est responsable d'un échange en particulier.
L'étape cruciale pour faire de la méthode d'échange d'isotopes hors équilibre une
technique utile, sans se laisser attirer par une complexité sans espoir, a été franchie
par BRITTON (1966). Il a réalisé que mesurer et comparer des transferts simultanés
entre un réactif et deux autres élimine en grande partie la complexité des expressions de vitesse en divisant l'une par les deux autres. Cela s'explique par le fait que
243
Cette capacité qu'ont de nombreux enzymes de catalyser des réactions partielles,
implique que les expériences d'échange d'isotopes nécessitent des enzymes mieux
purifiés que les expériences conventionnelles pour que les résultats soient valables.
La raison de cette nécessité est simple. Supposons que nous étudions l'aspartate
transaminase, qui catalyse la réaction suivante (que nous avons présenté avec plus
de détails dans l'équation [6.3]).
Glutamate + Oxaloacétate
2-oxoglutarate + Asparate
[7.8]
La présence dans la préparation d'enzyme de faibles quantités d'enzymes contaminants comme par exemple d'autres transaminases, a peu d'importance si nous
suivons la réaction complète car il est improbable qu'un de ces contaminants soit
capable de catalyser la réaction complète. Toutefois, l'échange entre le glutamate et
le 2-oxoglutarate représente un autre problème, en particulier si nous utilisons une
méthode très sensible de dosage, et nous devons nous assurer qu'aucune autre
transaminase n'est présente si nous voulons obtenir des informations sur l'aspartate
transaminase. Bien que cet avertissement s'applique en particulier aux enzymes qui
opèrent par un mécanisme à enzyme modifié, il n'est pas inutile d'apporter une
même attention à la pureté de la préparation d'enzyme lors de l'étude d'autres
enzymes, même si ceux-ci ne sont pas susceptibles de catalyser des réactions partielles ; comme nous en avons discuté à la fin du § 6.2.3, il pourrait y avoir plus
d'enzymes qui réagissent selon un mécanisme à enzyme modifié que ce qui n'est
généralement accepté.
7.5. ECHANGE D'ISOTOPES HORS ÉQUILIBRE
7.5.1. Rapports de flux chimiques
Comme nous l'avons noté ci-dessus, les équations de vitesse pour l'échange d'isotopes deviennent très compliquées si la réaction non-marquée n'est pas maintenue à
l'équilibre durant l'échange. Néanmoins, il y a une bonne raison pour étudier des
réactions enzymatiques qui ne sont pas à l'équilibre. A l'équilibre chimique il est
impossible de démêler les effets dus à la fixation du substrat de ceux dus à la
libération du produit, et, sauf si l'enzyme est capable de catalyser une demi-réaction
(§ 7.4), nous sommes obligés de considérer la réaction entière. L'échange d'isotopes hors d'équilibre, par contre, permet d'isoler et d'examiner séparément la partie
d'un mécanisme qui est responsable d'un échange en particulier.
L'étape cruciale pour faire de la méthode d'échange d'isotopes hors équilibre une
technique utile, sans se laisser attirer par une complexité sans espoir, a été franchie
par BRITTON (1966). Il a réalisé que mesurer et comparer des transferts simultanés
entre un réactif et deux autres élimine en grande partie la complexité des expressions de vitesse en divisant l'une par les deux autres. Cela s'explique par le fait que