7 – UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'ÉTUDE DES MÉCANISMES ENZYMATIQUES
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souvent d'apporter cette vérification. Elle a été introduite pour l'étude des
cinétiques enzymatiques par BOYER (1959), bien que le principe fondamental ait
été proposé plus tôt par MCKAY (1938) : même si, par définition, une réaction
chimique est à l'équilibre quand sa vitesse nette est égale à zéro, les vitesses
unidirectionnelles de certaines étapes ou de certains groupes d'étapes peuvent être
mesurées au moyen de traceurs isotopiques. L'utilisation de traceurs nonisotopiques est encore plus ancienne, remontant à l'investigation de l'oxydation des
acides gras par KNOOP (1904), mais, bien que des traceurs chimiques, comme le
groupe phényle, puissent fournir une information qualitative importante,
l'utilisation de traceurs dans les expériences cinétiques n'a été possible qu'avec
l'apparition des isotopes.
Utiliser la cinétique des réactions d'échanges d'isotopes, il est nécessaire de faire
deux hypothèses importantes. Elles sont habituellement vérifiées et souvent simplement sous-entendues, mais il est aussi bien de les énoncer clairement afin d'éviter
tout malentendu. La première hypothèse est qu'une réaction impliquant des substrats radioactifs suit le même mécanisme que la réaction normale, avec les mêmes
constantes de vitesse. En d'autres termes, les effets isotopiques (§ 7.6 et 7.7) sont
supposés négligeables. Cette supposition est généralement vraie, à condition que
3 H (Tritium) ne soit pas le marqueur radioactif. Même dans ce cas, les effets
isotopiques pourront être négligés si l'atome
3 H n'est pas directement impliqué dans
la réaction ou dans la fixation du substrat sur l'enzyme. La seconde hypothèse est
que les concentrations de toutes les espèces radioactives soient si faibles qu'elles
n'ont aucun effet perceptible sur les concentrations des espèces non marquées.
Cette hypothèse peut habituellement être satisfaite et constitue un point important
car, dans ce cas, les espèces marquées peuvent être ignorées dans le calcul des concentrations des espèces non-marquées, simplifiant ainsi considérablement l'analyse.
L'échange d'isotopes est plus facilement compris à l'aide d'un exemple, comme celui
présenté dans le schéma de la figure 7.1, qui représente le transfert d'un atome
radioactif (représenté par un astérisque) de A* vers P* dans le mécanisme ordonné à
complexe ternaire. Puisque cet échange implique que A* se fixe à E, il ne peut se
réaliser que si la concentration de E est suffisante.
k 2 [B]
k – 2
k –1
k 1 [A*]
k 3
k –3 [P*]
EA*
EQ
E
k –4 [Q]
k 4
k –3 [P]
k 3
k 1 [A]
k –1
EAB
EPQ
EA*B
EP*Q
EA
k 2 [B]
k –2
7.1 - Echange isotopique dans un mécanisme ordonné à complexe ternaire
Le schéma montre les étapes nécessaires pour le transfert du marqueur de A* à P*.
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souvent d'apporter cette vérification. Elle a été introduite pour l'étude des
cinétiques enzymatiques par BOYER (1959), bien que le principe fondamental ait
été proposé plus tôt par MCKAY (1938) : même si, par définition, une réaction
chimique est à l'équilibre quand sa vitesse nette est égale à zéro, les vitesses
unidirectionnelles de certaines étapes ou de certains groupes d'étapes peuvent être
mesurées au moyen de traceurs isotopiques. L'utilisation de traceurs nonisotopiques est encore plus ancienne, remontant à l'investigation de l'oxydation des
acides gras par KNOOP (1904), mais, bien que des traceurs chimiques, comme le
groupe phényle, puissent fournir une information qualitative importante,
l'utilisation de traceurs dans les expériences cinétiques n'a été possible qu'avec
l'apparition des isotopes.
Utiliser la cinétique des réactions d'échanges d'isotopes, il est nécessaire de faire
deux hypothèses importantes. Elles sont habituellement vérifiées et souvent simplement sous-entendues, mais il est aussi bien de les énoncer clairement afin d'éviter
tout malentendu. La première hypothèse est qu'une réaction impliquant des substrats radioactifs suit le même mécanisme que la réaction normale, avec les mêmes
constantes de vitesse. En d'autres termes, les effets isotopiques (§ 7.6 et 7.7) sont
supposés négligeables. Cette supposition est généralement vraie, à condition que
3 H (Tritium) ne soit pas le marqueur radioactif. Même dans ce cas, les effets
isotopiques pourront être négligés si l'atome
3 H n'est pas directement impliqué dans
la réaction ou dans la fixation du substrat sur l'enzyme. La seconde hypothèse est
que les concentrations de toutes les espèces radioactives soient si faibles qu'elles
n'ont aucun effet perceptible sur les concentrations des espèces non marquées.
Cette hypothèse peut habituellement être satisfaite et constitue un point important
car, dans ce cas, les espèces marquées peuvent être ignorées dans le calcul des concentrations des espèces non-marquées, simplifiant ainsi considérablement l'analyse.
L'échange d'isotopes est plus facilement compris à l'aide d'un exemple, comme celui
présenté dans le schéma de la figure 7.1, qui représente le transfert d'un atome
radioactif (représenté par un astérisque) de A* vers P* dans le mécanisme ordonné à
complexe ternaire. Puisque cet échange implique que A* se fixe à E, il ne peut se
réaliser que si la concentration de E est suffisante.
k 2 [B]
k – 2
k –1
k 1 [A*]
k 3
k –3 [P*]
EA*
EQ
E
k –4 [Q]
k 4
k –3 [P]
k 3
k 1 [A]
k –1
EAB
EPQ
EA*B
EP*Q
EA
k 2 [B]
k –2
7.1 - Echange isotopique dans un mécanisme ordonné à complexe ternaire
Le schéma montre les étapes nécessaires pour le transfert du marqueur de A* à P*.