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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
manifestent par leur absence : bien que cette absence ait des conséquences sérieuses
pour l'étude du métabolisme, elle est moins importante pour l'échange d'isotope en
tant que sonde cinétique des mécanismes enzymatiques, car presque toutes les molécules offrent la possibilité de réaliser le marquage d'un carbone ou d'un hydrogène
éloigné du site de la réaction.
Tableau 7.1 - Utilisations cinétique d'isotopes
Condition
Marquage isotopique Effets isotopiques
Localisation d'une
substitution
Eloigné du site
réactionnel
Liaison réactionnelle :
effets isotopiques primaires
Liaison voisine de la liaison réactionnelle : effets isotopiques secondaires
Solvant : effets isotopiques du solvant
Etendue de la substitution
Trace
100% (idéalement*)
Propriété utiles des isotopes Radioactivité
Masses atomiques différentes
Isotopes typiques
3 H,
14 C,
32 P
2 H,
3 H
* La substitution avec
3 H est uniquement possible à des niveaux de traces. Ceci signifie
que les expériences qui nécessitent la saturation de l'enzyme avec des molécules
substituées ne sont pas possibles avec
3 H.
L'utilisation d'isotopes dans des applications autres que cinétiques n'est pas obligatoirement en accord avec les généralisations données dans ce tableau. Par exemple les
isotopes lourds de l'oxygène (
17
O et
18
O) ont été utilisés avec succès pour étudier la
stéréochimie de réactions de substitution sur les atomes de phosphore, mais puisque ces
isotopes ne sont pas radioactifs ils ont été détectés par d'autres méthodes, comme la
résonance magnétique nucléaire (JARVEST, LOWE et POTTER, 1981) ou par spectrométrie de
masse (ABBOTT et al., 1979), qui ne sont pas suffisamment sensibles pour être utilisées
avec des quantités en trace de marqueur isotopique.
7.2. PRINCIPES DE L'ÉCHANGE D'ISOTOPE
Dans l'étude du mécanisme des réactions enzymatiques, l'analyse des vitesses
initiales de réaction à plusieurs substrats dans les directions directe et inverse, et en
présence ou en absence de produits, élimine généralement de nombreux chemins
réactionnels possibles et donne une bonne idée des caractéristiques générales du
mécanisme, mais elle ne révèle habituellement pas l'existence d'un chemin alternatif si celui-ci contribue de manière négligeable à la vitesse globale. Davantage
d'information est alors nécessaire pour obtenir une image représentative de la
réaction dans son ensemble. Même si un mécanisme clair émerge des mesures de
vitesse initiale et d'inhibition par le produit, il est utile de pouvoir confirmer
indépendamment sa validité. La technique importante d'échange d'isotope permet
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
manifestent par leur absence : bien que cette absence ait des conséquences sérieuses
pour l'étude du métabolisme, elle est moins importante pour l'échange d'isotope en
tant que sonde cinétique des mécanismes enzymatiques, car presque toutes les molécules offrent la possibilité de réaliser le marquage d'un carbone ou d'un hydrogène
éloigné du site de la réaction.
Tableau 7.1 - Utilisations cinétique d'isotopes
Condition
Marquage isotopique Effets isotopiques
Localisation d'une
substitution
Eloigné du site
réactionnel
Liaison réactionnelle :
effets isotopiques primaires
Liaison voisine de la liaison réactionnelle : effets isotopiques secondaires
Solvant : effets isotopiques du solvant
Etendue de la substitution
Trace
100% (idéalement*)
Propriété utiles des isotopes Radioactivité
Masses atomiques différentes
Isotopes typiques
3 H,
14 C,
32 P
2 H,
3 H
* La substitution avec
3 H est uniquement possible à des niveaux de traces. Ceci signifie
que les expériences qui nécessitent la saturation de l'enzyme avec des molécules
substituées ne sont pas possibles avec
3 H.
L'utilisation d'isotopes dans des applications autres que cinétiques n'est pas obligatoirement en accord avec les généralisations données dans ce tableau. Par exemple les
isotopes lourds de l'oxygène (
17
O et
18
O) ont été utilisés avec succès pour étudier la
stéréochimie de réactions de substitution sur les atomes de phosphore, mais puisque ces
isotopes ne sont pas radioactifs ils ont été détectés par d'autres méthodes, comme la
résonance magnétique nucléaire (JARVEST, LOWE et POTTER, 1981) ou par spectrométrie de
masse (ABBOTT et al., 1979), qui ne sont pas suffisamment sensibles pour être utilisées
avec des quantités en trace de marqueur isotopique.
7.2. PRINCIPES DE L'ÉCHANGE D'ISOTOPE
Dans l'étude du mécanisme des réactions enzymatiques, l'analyse des vitesses
initiales de réaction à plusieurs substrats dans les directions directe et inverse, et en
présence ou en absence de produits, élimine généralement de nombreux chemins
réactionnels possibles et donne une bonne idée des caractéristiques générales du
mécanisme, mais elle ne révèle habituellement pas l'existence d'un chemin alternatif si celui-ci contribue de manière négligeable à la vitesse globale. Davantage
d'information est alors nécessaire pour obtenir une image représentative de la
réaction dans son ensemble. Même si un mécanisme clair émerge des mesures de
vitesse initiale et d'inhibition par le produit, il est utile de pouvoir confirmer
indépendamment sa validité. La technique importante d'échange d'isotope permet