5 – INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES
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Pour réaliser une analyse de l’ensemble du phénomène et déterminer les paramètres cinétiques des différentes étapes, il est toutefois recommandé d’utiliser un
ajustement paramétrique non-linéaire en utilisant l’équation [5.40]. L’inhibition par
le substrat n’est généralement pas importante si les concentrations de substrat sont
maintenues inférieures ou égales aux concentrations physiologiques (bien qu’il existe
d’importantes exceptions, comme par exemple avec la phospho-fructokinase), mais
elle peut devenir prépondérante aux concentrations élevées de substrat et fournir ainsi
un élément diagnostique utile pour distinguer entre les chemins possibles de réaction,
comme nous en discuterons dans le § 6.6.
5.9. LA MODIFICATION D’UN GROUPE DE L’ENZYME COMME UN
MOYEN D’IDENTIFIER LES GROUPES ESSENTIELS
L’identification des groupes essentiels d’un enzyme constitue une étape importante
dans la caractérisation du mécanisme catalytique et une pratique courante consiste
à déduire la nature des groupes impliqués dans la catalyse enzymatique en déterminant si l’activité de l’enzyme est affectée lorsque certains résidus sont modifiés.
Malheureusement, le fait qu’un résidu particulier soit essentiel pour l’activité catalytique ne garantit pas qu’il joue un rôle quelconque dans le processus catalytique ;
il peut, par exemple, être essentiel pour maintenir la structure active de l’enzyme.
Il existe aujourd’hui, deux manières de modifier spécifiquement certains résidus.
La plus ancienne consiste à le modifier chimiquement par réaction avec un réactif
spécifique. Cette méthode a rendu de très grands services dans l’identification des
résidus essentiels des sites actifs et peut encore être très utile. De nombreux réactifs
sont disponibles pour modifier spécifiquement certains résidus d’acide aminé
(MEANS et FEENEY, 1971), ainsi par exemple, de nombreuses protéases extracellulaires comme la chymotrypsine ont un résidu sérine essentiel dans leur site actif qui
peut être mis en évidence par réaction avec le diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP).
Aujourd’hui cependant, grâce aux développements de l’ingénierie génétique, cette
approche a été largement supplantée par la mutagenèse dirigée qui permet de remplacer spécifiquement un acide aminé par n’importe quel autre acide aminé. De
nouvelles approches ont également été développées qui permettent l’introduction
d’acides aminés non-naturels dans les protéines (LIU et SCHULTZ, 1999 ; CHIN
et al., 2003) et nous pouvons penser que le développement commercial de ces
techniques ne devrait pas tarder, ce qui donnera encore plus de liberté dans ce type
d’expériences.
TSOU (1962) a établi les bases théoriques pour interpréter les résultats d’expériences de modifications chimiques, mais cet article n’est pas suffisamment connu
et en pratique la logique utilisée pour interpréter ces expériences est souvent floue
ou inexistante. Le cas le plus simple qui puisse être considéré est celui dans lequel
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Pour réaliser une analyse de l’ensemble du phénomène et déterminer les paramètres cinétiques des différentes étapes, il est toutefois recommandé d’utiliser un
ajustement paramétrique non-linéaire en utilisant l’équation [5.40]. L’inhibition par
le substrat n’est généralement pas importante si les concentrations de substrat sont
maintenues inférieures ou égales aux concentrations physiologiques (bien qu’il existe
d’importantes exceptions, comme par exemple avec la phospho-fructokinase), mais
elle peut devenir prépondérante aux concentrations élevées de substrat et fournir ainsi
un élément diagnostique utile pour distinguer entre les chemins possibles de réaction,
comme nous en discuterons dans le § 6.6.
5.9. LA MODIFICATION D’UN GROUPE DE L’ENZYME COMME UN
MOYEN D’IDENTIFIER LES GROUPES ESSENTIELS
L’identification des groupes essentiels d’un enzyme constitue une étape importante
dans la caractérisation du mécanisme catalytique et une pratique courante consiste
à déduire la nature des groupes impliqués dans la catalyse enzymatique en déterminant si l’activité de l’enzyme est affectée lorsque certains résidus sont modifiés.
Malheureusement, le fait qu’un résidu particulier soit essentiel pour l’activité catalytique ne garantit pas qu’il joue un rôle quelconque dans le processus catalytique ;
il peut, par exemple, être essentiel pour maintenir la structure active de l’enzyme.
Il existe aujourd’hui, deux manières de modifier spécifiquement certains résidus.
La plus ancienne consiste à le modifier chimiquement par réaction avec un réactif
spécifique. Cette méthode a rendu de très grands services dans l’identification des
résidus essentiels des sites actifs et peut encore être très utile. De nombreux réactifs
sont disponibles pour modifier spécifiquement certains résidus d’acide aminé
(MEANS et FEENEY, 1971), ainsi par exemple, de nombreuses protéases extracellulaires comme la chymotrypsine ont un résidu sérine essentiel dans leur site actif qui
peut être mis en évidence par réaction avec le diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP).
Aujourd’hui cependant, grâce aux développements de l’ingénierie génétique, cette
approche a été largement supplantée par la mutagenèse dirigée qui permet de remplacer spécifiquement un acide aminé par n’importe quel autre acide aminé. De
nouvelles approches ont également été développées qui permettent l’introduction
d’acides aminés non-naturels dans les protéines (LIU et SCHULTZ, 1999 ; CHIN
et al., 2003) et nous pouvons penser que le développement commercial de ces
techniques ne devrait pas tarder, ce qui donnera encore plus de liberté dans ce type
d’expériences.
TSOU (1962) a établi les bases théoriques pour interpréter les résultats d’expériences de modifications chimiques, mais cet article n’est pas suffisamment connu
et en pratique la logique utilisée pour interpréter ces expériences est souvent floue
ou inexistante. Le cas le plus simple qui puisse être considéré est celui dans lequel