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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
que le mélange de 1 mM ATP, 2 mM MgCl 2 et de 100 mM KCl contienne
1 mM ATP
4– , 2 mM Mg
2+ , 100 mM K
+ et 104 mM Cl
– .
2. Nous utilisons ces concentrations et les constantes de dissociation pour calculer
les concentrations de tous les complexes qui contiennent du Mg
2+ . Quand ces
concentrations seront additionnées, la concentration totale en Mg
2+ excèdera
(très certainement de manière importante dans le premier cycle de calcul) la
concentration totale réelle de cet ion.
3. Nous corrigeons la concentration de Mg
2+ libre en la multipliant par la
concentration réelle en Mg
2+ totale et en divisant par la concentration totale en
Mg
2+ calculée.
4. Nous répétons cette opération pour chacun des composants du mélange, c’est-àdire pour ATP
4– , K
+ et Cl
– dans cet exemple. En principe la concentration de H
+
peut être traitée de la même manière mais dans la pratique, la concentration de
H
+ libre est contrôlée et mesurée directement de telle sorte que la concentration
de H
+ ne devrait pas être corrigée durant les calculs mais maintenue constante à
sa valeur réelle.
5. Nous répétons l’ensemble du cycle, de l’étape 2 à l’étape 4, jusqu’à ce que les
résultats soient consistants avec eux-mêmes, c’est-à-dire jusqu’à ce que les
concentrations ne varient plus d’un cycle à l’autre.
Cette procédure est celle, légèrement modifiée, qui a été proposée par PERRIN
(1965) et par PERRIN et SAYCE (1967). Bien que le nombre requis de cycles soit
certainement trop important pour permettre un calcul manuel, la méthode peut
facilement être implémentée dans un programme d’ordinateur (STORER et
CORNISH-BOWDEN, 1976), et peut être utilisée facilement et efficacement pour les
problèmes couramment rencontrés dans les études de cinétique enzymatique.
L’expérience de l’utilisation d’un tel programme a permis de mettre au point une
manière de varier la concentration de MgATP
2– en conservant le contrôle des
variations de la concentration des autres ions. Deux approches sont couramment
utilisées, dont l’une donne d’excellents résultats et l’autre de mauvais résultats.
La « bonne » méthode consiste à maintenir la concentration totale de MgCl 2
constamment en excès par rapport à la concentration totale d’ATP. Les meilleurs
résultats sont obtenus avec une concentration en excès de 5 mM MgCl 2 , mais si
l’enzyme est inhibée par le Mg
2+ libre ou s’il existe d’autres raisons pour réduire
la concentration de Mg
2+ libre, l’excès peut être réduit jusqu’à 1 mM sans perte
d’efficacité. Si l’excès est supérieur à 10 mM, des problèmes peuvent apparaître à
cause de la présence d’une concentration significative de Mg 2 ATP. Avec cette
méthode, la concentration d’ATP peut varier sur une large gamme (allant de 1 μM
jusqu’à 0,1 M) avec une proportion importante et presque constante de l’ATP
existant sous la forme de MgATP
2– et une concentration presque constante de Mg
2+
libre. Donc les effets dus à la variation de la concentration de MgATP
2– peuvent
être clairement séparés de ceux dus à la variation de Mg
2+ libre.
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
que le mélange de 1 mM ATP, 2 mM MgCl 2 et de 100 mM KCl contienne
1 mM ATP
4– , 2 mM Mg
2+ , 100 mM K
+ et 104 mM Cl
– .
2. Nous utilisons ces concentrations et les constantes de dissociation pour calculer
les concentrations de tous les complexes qui contiennent du Mg
2+ . Quand ces
concentrations seront additionnées, la concentration totale en Mg
2+ excèdera
(très certainement de manière importante dans le premier cycle de calcul) la
concentration totale réelle de cet ion.
3. Nous corrigeons la concentration de Mg
2+ libre en la multipliant par la
concentration réelle en Mg
2+ totale et en divisant par la concentration totale en
Mg
2+ calculée.
4. Nous répétons cette opération pour chacun des composants du mélange, c’est-àdire pour ATP
4– , K
+ et Cl
– dans cet exemple. En principe la concentration de H
+
peut être traitée de la même manière mais dans la pratique, la concentration de
H
+ libre est contrôlée et mesurée directement de telle sorte que la concentration
de H
+ ne devrait pas être corrigée durant les calculs mais maintenue constante à
sa valeur réelle.
5. Nous répétons l’ensemble du cycle, de l’étape 2 à l’étape 4, jusqu’à ce que les
résultats soient consistants avec eux-mêmes, c’est-à-dire jusqu’à ce que les
concentrations ne varient plus d’un cycle à l’autre.
Cette procédure est celle, légèrement modifiée, qui a été proposée par PERRIN
(1965) et par PERRIN et SAYCE (1967). Bien que le nombre requis de cycles soit
certainement trop important pour permettre un calcul manuel, la méthode peut
facilement être implémentée dans un programme d’ordinateur (STORER et
CORNISH-BOWDEN, 1976), et peut être utilisée facilement et efficacement pour les
problèmes couramment rencontrés dans les études de cinétique enzymatique.
L’expérience de l’utilisation d’un tel programme a permis de mettre au point une
manière de varier la concentration de MgATP
2– en conservant le contrôle des
variations de la concentration des autres ions. Deux approches sont couramment
utilisées, dont l’une donne d’excellents résultats et l’autre de mauvais résultats.
La « bonne » méthode consiste à maintenir la concentration totale de MgCl 2
constamment en excès par rapport à la concentration totale d’ATP. Les meilleurs
résultats sont obtenus avec une concentration en excès de 5 mM MgCl 2 , mais si
l’enzyme est inhibée par le Mg
2+ libre ou s’il existe d’autres raisons pour réduire
la concentration de Mg
2+ libre, l’excès peut être réduit jusqu’à 1 mM sans perte
d’efficacité. Si l’excès est supérieur à 10 mM, des problèmes peuvent apparaître à
cause de la présence d’une concentration significative de Mg 2 ATP. Avec cette
méthode, la concentration d’ATP peut varier sur une large gamme (allant de 1 μM
jusqu’à 0,1 M) avec une proportion importante et presque constante de l’ATP
existant sous la forme de MgATP
2– et une concentration presque constante de Mg
2+
libre. Donc les effets dus à la variation de la concentration de MgATP
2– peuvent
être clairement séparés de ceux dus à la variation de Mg
2+ libre.