4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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La « mauvaise » méthode, qui est malheureusement tout aussi couramment
rencontrée dans la littérature, consiste faire varier les concentrations totales d’ATP
et de MgCl 2 en maintenant leur rapport constant. Si le rapport est 1 : 1 ou n’importe
quelle autre valeur, cette méthode conduit à de grandes variations dans la
proportion d’ATP présente dans l’une ou l’autre forme et ne peut pas être
recommandée. Bien que moins critiquable, mais néanmoins peu recommandable, il
existe également une méthode qui consiste à garder constante la concentration
totale de MgCl 2 à une valeur excédant de 2 à 5 mM la plus haute concentration
d’ATP. Bien que cette méthode assure que l’ATP existe largement sous la forme de
MgATP
2– , elle peut conduire à de grandes variations dans les concentrations de
Mg
2+ libre et de Mg 2 ATP.
Bien que les conclusions soulignées dans les paragraphes précédents dépendent
d’une certaine manière des valeurs numériques des constantes d’équilibre pour les
complexes de Mg
2+ , d’ATP
4– et de H
+
, les principes sont généraux. Comme règle
grossière, un composé A d’un complexe binaire AB existe largement sous la forme
complexée si B est maintenu en excès par rapport à A d’une quantité correspondant
à environ 100 fois la valeur de la constante de dissociation.
Dans cette discussion, nous avons simplifié le problème en ignorant le fait que les
constantes ioniques définissent des rapports d’activités plutôt que de
concentrations. En pratique, pour éviter les complications inhérentes à l’utilisation
des coefficients d’activité, il est recommandé de travailler à force ionique
constante. Une valeur de l’ordre de 0,15 M est appropriée, à la fois parce qu’elle
est proche de la force ionique de nombreuses cellules vivantes et parce que de
nombreux équilibres d’intérêt biochimique sont insensibles aux variations de la
force ionique dans cette gamme de valeur.
PROBLÈMES
4.1 - L’hexokinase A de cerveau de mammifère est fortement inhibée par le
glucose 6-phosphate à des concentrations supérieures à 0,1 mM. Quelle
devrait être la vitesse limite V 2 de la glucose 6-phosphate déshydrogénase
(K m = 0,11 mM pour le glucose 6-phosphate) si cet enzyme était utilisé
comme enzyme couplé dans un test pour lequel des vitesses v 1 n’excédant pas 0,1 mM min
–1 devraient être mesurées et si la concentration de
glucose 6-phosphate n’excédait jamais 0,1 mM ?
4.2 - Maintenir une concentration totale de MgCl 2 de 5 mM en excès de la
concentration totale d’ATP assure que les effets dus au MgATP
2– et au
Mg
2+ peuvent être clairement séparés, parce que cette procédure permet
une variation de la concentration de MgATP
2– qui s’accompagne de
faibles variations concomitantes de la concentration de Mg
2+ libre.
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La « mauvaise » méthode, qui est malheureusement tout aussi couramment
rencontrée dans la littérature, consiste faire varier les concentrations totales d’ATP
et de MgCl 2 en maintenant leur rapport constant. Si le rapport est 1 : 1 ou n’importe
quelle autre valeur, cette méthode conduit à de grandes variations dans la
proportion d’ATP présente dans l’une ou l’autre forme et ne peut pas être
recommandée. Bien que moins critiquable, mais néanmoins peu recommandable, il
existe également une méthode qui consiste à garder constante la concentration
totale de MgCl 2 à une valeur excédant de 2 à 5 mM la plus haute concentration
d’ATP. Bien que cette méthode assure que l’ATP existe largement sous la forme de
MgATP
2– , elle peut conduire à de grandes variations dans les concentrations de
Mg
2+ libre et de Mg 2 ATP.
Bien que les conclusions soulignées dans les paragraphes précédents dépendent
d’une certaine manière des valeurs numériques des constantes d’équilibre pour les
complexes de Mg
2+ , d’ATP
4– et de H
+
, les principes sont généraux. Comme règle
grossière, un composé A d’un complexe binaire AB existe largement sous la forme
complexée si B est maintenu en excès par rapport à A d’une quantité correspondant
à environ 100 fois la valeur de la constante de dissociation.
Dans cette discussion, nous avons simplifié le problème en ignorant le fait que les
constantes ioniques définissent des rapports d’activités plutôt que de
concentrations. En pratique, pour éviter les complications inhérentes à l’utilisation
des coefficients d’activité, il est recommandé de travailler à force ionique
constante. Une valeur de l’ordre de 0,15 M est appropriée, à la fois parce qu’elle
est proche de la force ionique de nombreuses cellules vivantes et parce que de
nombreux équilibres d’intérêt biochimique sont insensibles aux variations de la
force ionique dans cette gamme de valeur.
PROBLÈMES
4.1 - L’hexokinase A de cerveau de mammifère est fortement inhibée par le
glucose 6-phosphate à des concentrations supérieures à 0,1 mM. Quelle
devrait être la vitesse limite V 2 de la glucose 6-phosphate déshydrogénase
(K m = 0,11 mM pour le glucose 6-phosphate) si cet enzyme était utilisé
comme enzyme couplé dans un test pour lequel des vitesses v 1 n’excédant pas 0,1 mM min
–1 devraient être mesurées et si la concentration de
glucose 6-phosphate n’excédait jamais 0,1 mM ?
4.2 - Maintenir une concentration totale de MgCl 2 de 5 mM en excès de la
concentration totale d’ATP assure que les effets dus au MgATP
2– et au
Mg
2+ peuvent être clairement séparés, parce que cette procédure permet
une variation de la concentration de MgATP
2– qui s’accompagne de
faibles variations concomitantes de la concentration de Mg
2+ libre.