4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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l’expérience et non localisées dans le temps) et de doubler le reste. Si, d’un autre
côté, il n’est pas possible de réaliser plus de 30 mesures, il faudra réduire le
nombre de répétitions. Il est stupide de défendre une règle stipulant que chaque
mesure doit être effectuée 3 fois, non seulement parce que cela simplifie le
problème, mais aussi parce que cela peut conduire à des expériences dans
lesquelles trop peu de conditions sont étudiées pour obtenir l’information attendue.
4.4. TRAITEMENT DES ÉQUILIBRES IONIQUES
Dans beaucoup de réactions biochimiques, le substrat n’est pas un composé bien
caractérisé dont la concentration est directement mesurable, mais est un ion en
équilibre avec d’autres ions ayant leurs propres interactions avec les enzymes
catalysant les réactions. Le plus notable de ces ions est le MgATP
2– , qui est le vrai
substrat de la majorité des enzymes regroupés dans la catégorie des enzymes
dépendantes de l’ATP. Il est impossible de préparer une solution de MgATP
2–
,
parce que toute solution contenant du MgATP
2– contient aussi de nombreux autres
ions. Par exemple, un mélange équimolaire d’ATP et de MgCl 2 à pH 7 contient des
proportions appréciables de MgATP
2– , d’ATP
4– , de HATP
3– , de Mg
2+ et de Cl
– ,
ainsi que des traces de MgHATP
– , de Mg 2 ATP et de MgCl
+
. De plus, leurs
proportions varient avec les concentrations totales d’ATP et de MgCl 2 , avec le pH,
la force ionique et les concentrations d’autres espèces moléculaires éventuellement
présentes (comme par exemple des composés de tampons).
Manifestement, si nous étudions l’effet de la concentration de MgATP
2– , par
exemple, sur un enzyme, nous devons nous assurer que les effets sont dus à la
variation de la concentration de MgATP
2– et non à celles des concentrations de
Mg
2+ ou d’ATP
4– qui l'accompagnent. Il est donc nécessaire de disposer d’une
méthode permettant de calculer la composition d’un mélange d’ions et il est
souhaitable de disposer d’un moyen permettant de modifier la concentration d’une
des espèces sans modifier substantiellement la concentration des autres espèces.
Les constantes de dissociation de nombreux ions d’intérêt biochimique ont été
déterminées. Il est donc facile de déterminer la concentration des complexes à
condition de connaître la concentration des divers composants sous forme libre.
Malheureusement, on est généralement confronté au problème inverse qui consiste
à déterminer la concentration des formes libres en connaissant les concentrations
totales des différents composés. Par exemple, il peut être nécessaire, connaissant
les concentrations totales d’ATP et de MgCl 2 , le pH et toutes les constantes d’équilibre, de calculer la concentration de MgATP
2– . Une manière simple et efficace de
procéder est la suivante :
1. Nous supposons initialement qu’aucun complexe n’est formé et que toutes les
espèces ioniques sont complètement dissociées. Par exemple, nous supposons
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l’expérience et non localisées dans le temps) et de doubler le reste. Si, d’un autre
côté, il n’est pas possible de réaliser plus de 30 mesures, il faudra réduire le
nombre de répétitions. Il est stupide de défendre une règle stipulant que chaque
mesure doit être effectuée 3 fois, non seulement parce que cela simplifie le
problème, mais aussi parce que cela peut conduire à des expériences dans
lesquelles trop peu de conditions sont étudiées pour obtenir l’information attendue.
4.4. TRAITEMENT DES ÉQUILIBRES IONIQUES
Dans beaucoup de réactions biochimiques, le substrat n’est pas un composé bien
caractérisé dont la concentration est directement mesurable, mais est un ion en
équilibre avec d’autres ions ayant leurs propres interactions avec les enzymes
catalysant les réactions. Le plus notable de ces ions est le MgATP
2– , qui est le vrai
substrat de la majorité des enzymes regroupés dans la catégorie des enzymes
dépendantes de l’ATP. Il est impossible de préparer une solution de MgATP
2–
,
parce que toute solution contenant du MgATP
2– contient aussi de nombreux autres
ions. Par exemple, un mélange équimolaire d’ATP et de MgCl 2 à pH 7 contient des
proportions appréciables de MgATP
2– , d’ATP
4– , de HATP
3– , de Mg
2+ et de Cl
– ,
ainsi que des traces de MgHATP
– , de Mg 2 ATP et de MgCl
+
. De plus, leurs
proportions varient avec les concentrations totales d’ATP et de MgCl 2 , avec le pH,
la force ionique et les concentrations d’autres espèces moléculaires éventuellement
présentes (comme par exemple des composés de tampons).
Manifestement, si nous étudions l’effet de la concentration de MgATP
2– , par
exemple, sur un enzyme, nous devons nous assurer que les effets sont dus à la
variation de la concentration de MgATP
2– et non à celles des concentrations de
Mg
2+ ou d’ATP
4– qui l'accompagnent. Il est donc nécessaire de disposer d’une
méthode permettant de calculer la composition d’un mélange d’ions et il est
souhaitable de disposer d’un moyen permettant de modifier la concentration d’une
des espèces sans modifier substantiellement la concentration des autres espèces.
Les constantes de dissociation de nombreux ions d’intérêt biochimique ont été
déterminées. Il est donc facile de déterminer la concentration des complexes à
condition de connaître la concentration des divers composants sous forme libre.
Malheureusement, on est généralement confronté au problème inverse qui consiste
à déterminer la concentration des formes libres en connaissant les concentrations
totales des différents composés. Par exemple, il peut être nécessaire, connaissant
les concentrations totales d’ATP et de MgCl 2 , le pH et toutes les constantes d’équilibre, de calculer la concentration de MgATP
2– . Une manière simple et efficace de
procéder est la suivante :
1. Nous supposons initialement qu’aucun complexe n’est formé et que toutes les
espèces ioniques sont complètement dissociées. Par exemple, nous supposons