4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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Il est difficile de ne pas souligner que les remarques faites ci-dessus sont inhérentes
au respect du mécanisme de MICHAELIS et MENTEN, ou du moins que l’on ne se
soucie pas du respect de ce modèle en dehors de la gamme de l’expérience. Si nous
nous intéressons à une réaction dans des conditions physiologiques, il n’y a pas de
raisons de nous soucier des déviations par rapport à un comportement simple qui
peuvent survenir dans des conditions non-physiologiques ; néanmoins, si nous nous
intéressons au mécanisme cinétique de la réaction, il est souhaitable d’étendre
autant que possible la gamme de conditions utilisées, puisque des déviations dans
le comportement de l’enzyme dans les conditions extrêmes peuvent être utiles pour
l’établissement du mécanisme. HILL, WAIGHT et BARDSLEY (1977) ont discuté le
fait que très peu d’enzymes (si du moins ils en existent certains) obéissent
réellement à l’équation de MICHAELIS et MENTEN. Ils pensent que le nombre limité
de conditions expérimentales, associé au manque de volonté de rendre compte de
l’observation de faibles déviations vis-à-vis du comportement attendu, ont conduit
à une supposition injustifiée que les cinétiques enzymatiques obéissaient de
manière presque universelle à l’équation de MICHAELIS et MENTEN. Pratiquement,
tous les exemples standards et traditionnels de cinétiques simples se sont révélés,
selon eux, plus complexes lorsque des études soigneuses ont été réalisées.
L’équation de MICHAELIS et MENTEN reste sans nul doute utile en première
approximation dans les études cinétiques, même si quelques fois des mesures
précises conduisent à son rejet. Cependant, il est toujours conseillé de vérifier
l’absence des déviations les plus communes. La vitesse initiale est-elle nulle en
absence de substrat (et d’enzyme) ? Si ce n’est pas le cas, la déviation est-elle
suffisamment petite pour être expliquée par les erreurs expérimentales ? S’il y a
une variation résiduelle du signal en absence de substrat ou d’enzyme, est-il
possible de l’éliminer par purification ? La vitesse tend-elle vers zéro pour des
concentrations de substrat largement différentes de zéro ? Dans ce cas, il sera utile
de vérifier la coopérativité de la réaction (voir chapitre 9). Existe-t-il une indication
de l’inhibition par le substrat ou par le produit, par exemple, une diminution de v
lorsque [ ]
A augmente ? Même si la vitesse ne diminue pas, une augmentation de
v avec une concentration [ ]
A plus faible que celle prévue par l’équation de
MICHAELIS et MENTEN peut indiquer une inhibition par le substrat.
4.3.2. Choix du pH, de la température et des autres conditions
Même s’il n’est pas dans votre intention d’étudier les dépendances de la réaction
enzymatique au pH ou à la température, il est nécessaire de bien choisir les
conditions dans lesquelles la réaction est étudiée. Pour de nombreuses applications,
il est approprié de travailler dans des conditions proches des conditions
physiologiques – par exemple pH 7,5 - 37
ο C et une force ionique de 0,15 M pour la
plupart des enzymes produites par des mammifères – mais il existe aussi de
nombreuses bonnes raisons d’utiliser d’autres conditions dans l’étude des
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Il est difficile de ne pas souligner que les remarques faites ci-dessus sont inhérentes
au respect du mécanisme de MICHAELIS et MENTEN, ou du moins que l’on ne se
soucie pas du respect de ce modèle en dehors de la gamme de l’expérience. Si nous
nous intéressons à une réaction dans des conditions physiologiques, il n’y a pas de
raisons de nous soucier des déviations par rapport à un comportement simple qui
peuvent survenir dans des conditions non-physiologiques ; néanmoins, si nous nous
intéressons au mécanisme cinétique de la réaction, il est souhaitable d’étendre
autant que possible la gamme de conditions utilisées, puisque des déviations dans
le comportement de l’enzyme dans les conditions extrêmes peuvent être utiles pour
l’établissement du mécanisme. HILL, WAIGHT et BARDSLEY (1977) ont discuté le
fait que très peu d’enzymes (si du moins ils en existent certains) obéissent
réellement à l’équation de MICHAELIS et MENTEN. Ils pensent que le nombre limité
de conditions expérimentales, associé au manque de volonté de rendre compte de
l’observation de faibles déviations vis-à-vis du comportement attendu, ont conduit
à une supposition injustifiée que les cinétiques enzymatiques obéissaient de
manière presque universelle à l’équation de MICHAELIS et MENTEN. Pratiquement,
tous les exemples standards et traditionnels de cinétiques simples se sont révélés,
selon eux, plus complexes lorsque des études soigneuses ont été réalisées.
L’équation de MICHAELIS et MENTEN reste sans nul doute utile en première
approximation dans les études cinétiques, même si quelques fois des mesures
précises conduisent à son rejet. Cependant, il est toujours conseillé de vérifier
l’absence des déviations les plus communes. La vitesse initiale est-elle nulle en
absence de substrat (et d’enzyme) ? Si ce n’est pas le cas, la déviation est-elle
suffisamment petite pour être expliquée par les erreurs expérimentales ? S’il y a
une variation résiduelle du signal en absence de substrat ou d’enzyme, est-il
possible de l’éliminer par purification ? La vitesse tend-elle vers zéro pour des
concentrations de substrat largement différentes de zéro ? Dans ce cas, il sera utile
de vérifier la coopérativité de la réaction (voir chapitre 9). Existe-t-il une indication
de l’inhibition par le substrat ou par le produit, par exemple, une diminution de v
lorsque [ ]
A augmente ? Même si la vitesse ne diminue pas, une augmentation de
v avec une concentration [ ]
A plus faible que celle prévue par l’équation de
MICHAELIS et MENTEN peut indiquer une inhibition par le substrat.
4.3.2. Choix du pH, de la température et des autres conditions
Même s’il n’est pas dans votre intention d’étudier les dépendances de la réaction
enzymatique au pH ou à la température, il est nécessaire de bien choisir les
conditions dans lesquelles la réaction est étudiée. Pour de nombreuses applications,
il est approprié de travailler dans des conditions proches des conditions
physiologiques – par exemple pH 7,5 - 37
ο C et une force ionique de 0,15 M pour la
plupart des enzymes produites par des mammifères – mais il existe aussi de
nombreuses bonnes raisons d’utiliser d’autres conditions dans l’étude des