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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
il existe deux raisons pour lesquelles ceci n’est pas toujours vrai. Premièrement, le
respect de l’équation de MICHAELIS et MENTEN peut ne pas être absolu : beaucoup
d’enzymes se caractérisent par une inhibition par le substrat pour des valeurs
élevées de [] A , et en conséquence les valeurs de v mesurées à des concentrations
élevées peuvent ne pas être en accord avec les valeurs de K m et de V qui définissent
les cinétiques à des valeurs faibles et modérées de [] A . Deuxièmement, même si
l’équation de MICHAELIS et MENTEN est précisément respectée, l’avantage
d’inclure des valeurs de [] A supérieures à 10 K m est faible et peut être invalidé par
le coût additionnel que ces mesures représentent. De plus, si le substrat est un ion,
il peut être difficile d’éviter une variation de la force ionique lorsque des
concentrations excessives sont utilisées.
Une limite sur la concentration maximale de substrat qui peut être utilisée est
souvent imposée par l’absorbance spécifique du substrat ou du produit utilisé pour
la mesure d’activité. Par exemple, de nombreuses mesures d’activité enzymatique
sont basées sur l’absorbance du NAD red à 340 nm, qui est d’environ 0,9 dans une
cuve de 1 cm pour une solution de 0,15 mM. Ceci suggère que des mesures à des
concentrations supérieures soient difficiles, bien que l’utilisation d’une cuve de
0,2 cm permette d’étendre la gamme de concentration de substrat d’un facteur 5.
Curieusement, les cuves de 1 cm de trajet optique sont devenues tellement
familières que certains utilisateurs semblent ignorer cette possibilité d’utiliser
d’autres longueurs de trajet optique. A l’opposé, des cuves de 5 ou 10 cm peuvent
être utiles pour suivre des solutions qui absorbent très peu, bien que celles-ci
puissent être plus difficiles à utiliser si leur utilisation nécessite la modification du
spectrophotomètre.
De la même manière que la vitesse à haute concentration de substrat est déterminée
par V, la vitesse à faible concentration est déterminée par V/K m (voir § 3.3). Dès
lors, pour que V/K m soit correctement déterminé, il est nécessaire de réaliser des
mesures de v à des valeurs de [] A inférieures à K m . Il n’est pas nécessaire de
chercher à utiliser des valeurs de [] A aussi petites que possible, puisque la
condition v = 0 imposée pour [] A = 0 fournit un point fixe par lequel le graphique
de v en fonction de [] A doit obligatoirement passer. Dès lors, il y a peu d’intérêt à
mesurer des valeurs de v à des valeurs de [] A inférieures à 0,2 K m . S’il existe un
intérêt quelconque, il dépend de la manière dont les erreurs sur v sont distribuées :
si v a une déviation standard constante, une valeur optimale pour le bas de la
gamme des valeurs de [] A est environ 0,8 K m (la valeur exacte dépendant de la
valeur supérieure de la gamme), mais si v a un coefficient constant de variation, la
valeur optimale pour le bas de la gamme est zéro (ENDRENYI, 1981). La valeur de
0,2 K m est un bon compromis, généralement satisfaisant, entre ces deux situations.
La détermination de K m nécessite des valeurs précises aussi bien de V que de V/K m ;
donc la gamme de [] A devrait s’étendre de 0,2 K m jusqu’à 10 K m ou jusqu’à la
concentration de A la plus élevée possible.
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
il existe deux raisons pour lesquelles ceci n’est pas toujours vrai. Premièrement, le
respect de l’équation de MICHAELIS et MENTEN peut ne pas être absolu : beaucoup
d’enzymes se caractérisent par une inhibition par le substrat pour des valeurs
élevées de [] A , et en conséquence les valeurs de v mesurées à des concentrations
élevées peuvent ne pas être en accord avec les valeurs de K m et de V qui définissent
les cinétiques à des valeurs faibles et modérées de [] A . Deuxièmement, même si
l’équation de MICHAELIS et MENTEN est précisément respectée, l’avantage
d’inclure des valeurs de [] A supérieures à 10 K m est faible et peut être invalidé par
le coût additionnel que ces mesures représentent. De plus, si le substrat est un ion,
il peut être difficile d’éviter une variation de la force ionique lorsque des
concentrations excessives sont utilisées.
Une limite sur la concentration maximale de substrat qui peut être utilisée est
souvent imposée par l’absorbance spécifique du substrat ou du produit utilisé pour
la mesure d’activité. Par exemple, de nombreuses mesures d’activité enzymatique
sont basées sur l’absorbance du NAD red à 340 nm, qui est d’environ 0,9 dans une
cuve de 1 cm pour une solution de 0,15 mM. Ceci suggère que des mesures à des
concentrations supérieures soient difficiles, bien que l’utilisation d’une cuve de
0,2 cm permette d’étendre la gamme de concentration de substrat d’un facteur 5.
Curieusement, les cuves de 1 cm de trajet optique sont devenues tellement
familières que certains utilisateurs semblent ignorer cette possibilité d’utiliser
d’autres longueurs de trajet optique. A l’opposé, des cuves de 5 ou 10 cm peuvent
être utiles pour suivre des solutions qui absorbent très peu, bien que celles-ci
puissent être plus difficiles à utiliser si leur utilisation nécessite la modification du
spectrophotomètre.
De la même manière que la vitesse à haute concentration de substrat est déterminée
par V, la vitesse à faible concentration est déterminée par V/K m (voir § 3.3). Dès
lors, pour que V/K m soit correctement déterminé, il est nécessaire de réaliser des
mesures de v à des valeurs de [] A inférieures à K m . Il n’est pas nécessaire de
chercher à utiliser des valeurs de [] A aussi petites que possible, puisque la
condition v = 0 imposée pour [] A = 0 fournit un point fixe par lequel le graphique
de v en fonction de [] A doit obligatoirement passer. Dès lors, il y a peu d’intérêt à
mesurer des valeurs de v à des valeurs de [] A inférieures à 0,2 K m . S’il existe un
intérêt quelconque, il dépend de la manière dont les erreurs sur v sont distribuées :
si v a une déviation standard constante, une valeur optimale pour le bas de la
gamme des valeurs de [] A est environ 0,8 K m (la valeur exacte dépendant de la
valeur supérieure de la gamme), mais si v a un coefficient constant de variation, la
valeur optimale pour le bas de la gamme est zéro (ENDRENYI, 1981). La valeur de
0,2 K m est un bon compromis, généralement satisfaisant, entre ces deux situations.
La détermination de K m nécessite des valeurs précises aussi bien de V que de V/K m ;
donc la gamme de [] A devrait s’étendre de 0,2 K m jusqu’à 10 K m ou jusqu’à la
concentration de A la plus élevée possible.