4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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Le principe de base sur lequel repose le test de SELWYN était déjà bien connu aux
premiers temps de l’enzymologie : les données présentées dans la figure 4.3a sont
celles de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et des données similaires sont fournies
par HUDSON (1908) ; il est clair, de plus, selon la discussion donnée par HALDANE
(1930) que de tels tests étaient appliqués à l’époque à de nombreux enzymes. Dès
1890, O’SULLIVAN et TOMPSON ont commenté que le temps nécessaire pour
atteindre un pourcentage donné d’inversion (c’est-à-dire d’hydrolyse du sucrose)
est inversement proportionnel à la quantité présente de matériel inversé ; en
d’autres termes, le temps est inversement proportionnel à la quantité d’agent
inversant. En dépit de cela, le test a été largement oublié jusqu’à ce que SELWYN
(1965) adapte le traitement donné par MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et discute
les diverses raisons possibles de son échec. On peut se demander combien de
techniques aussi utiles restent cachées dans la littérature ancienne.
4.3. CHOIX DES CONDITIONS EXPÉRIMENTALES
4.3.1. Choix des concentrations de substrat
Un exposé complet de la mise au point d’expériences de cinétique enzymatique
serait trop long pour être traité ici, et donc dans ce paragraphe nous présenterons
uniquement un guide bref et simplifié. En général, les conditions optimales pour
tester l’activité d’un enzyme, c’est-à-dire pour déterminer la quantité d’activité
catalytique dans un échantillon, ne correspondent pas aux conditions idéales
permettant de déterminer les paramètres cinétiques. La raison est que dans un test
d’activité enzymatique, nous cherchons à obtenir des conditions où la vitesse
mesurée dépend uniquement de la concentration d’enzyme, de sorte que de faibles
variations des autres paramètres aient peu d’effet ; par contre dans une étude des
propriétés cinétiques d’un enzyme, il est nécessaire de déterminer comment celuici répond aux changements de conditions. Il est essentiel dans ce dernier cas de
travailler sur une large gamme de concentrations de substrat pour laquelle la vitesse
varie de manière appréciable. En pratique, pour un enzyme qui obéit à l’équation
de MICHAELIS et MENTEN, cela signifie que les valeurs de [] A s’étendent bien en
dessous et bien au dessus de K m .
Si le système étudié obéit à l’équation de MICHAELIS et MENTEN, il est seulement
nécessaire de déterminer quelle gamme de [] A est suffisante pour définir K m et V
précisément. Il est facile de décider comment on peut définir V précisément, en
rappelant que v tend vers V lorsque [] A augmente (§ 3.3) ; clairement, il est utile
de réaliser des mesures de v à des concentrations de [] A aussi élevées que le coût,
la solubilité ou toute autre contrainte (comme une absorbance élevée dans le cas
d’une mesure utilisant un spectromètre) le permettent. En principe, plus la
concentration [] A utilisée sera grande et meilleure sera la mesure, mais en réalité
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Le principe de base sur lequel repose le test de SELWYN était déjà bien connu aux
premiers temps de l’enzymologie : les données présentées dans la figure 4.3a sont
celles de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et des données similaires sont fournies
par HUDSON (1908) ; il est clair, de plus, selon la discussion donnée par HALDANE
(1930) que de tels tests étaient appliqués à l’époque à de nombreux enzymes. Dès
1890, O’SULLIVAN et TOMPSON ont commenté que le temps nécessaire pour
atteindre un pourcentage donné d’inversion (c’est-à-dire d’hydrolyse du sucrose)
est inversement proportionnel à la quantité présente de matériel inversé ; en
d’autres termes, le temps est inversement proportionnel à la quantité d’agent
inversant. En dépit de cela, le test a été largement oublié jusqu’à ce que SELWYN
(1965) adapte le traitement donné par MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et discute
les diverses raisons possibles de son échec. On peut se demander combien de
techniques aussi utiles restent cachées dans la littérature ancienne.
4.3. CHOIX DES CONDITIONS EXPÉRIMENTALES
4.3.1. Choix des concentrations de substrat
Un exposé complet de la mise au point d’expériences de cinétique enzymatique
serait trop long pour être traité ici, et donc dans ce paragraphe nous présenterons
uniquement un guide bref et simplifié. En général, les conditions optimales pour
tester l’activité d’un enzyme, c’est-à-dire pour déterminer la quantité d’activité
catalytique dans un échantillon, ne correspondent pas aux conditions idéales
permettant de déterminer les paramètres cinétiques. La raison est que dans un test
d’activité enzymatique, nous cherchons à obtenir des conditions où la vitesse
mesurée dépend uniquement de la concentration d’enzyme, de sorte que de faibles
variations des autres paramètres aient peu d’effet ; par contre dans une étude des
propriétés cinétiques d’un enzyme, il est nécessaire de déterminer comment celuici répond aux changements de conditions. Il est essentiel dans ce dernier cas de
travailler sur une large gamme de concentrations de substrat pour laquelle la vitesse
varie de manière appréciable. En pratique, pour un enzyme qui obéit à l’équation
de MICHAELIS et MENTEN, cela signifie que les valeurs de [] A s’étendent bien en
dessous et bien au dessus de K m .
Si le système étudié obéit à l’équation de MICHAELIS et MENTEN, il est seulement
nécessaire de déterminer quelle gamme de [] A est suffisante pour définir K m et V
précisément. Il est facile de décider comment on peut définir V précisément, en
rappelant que v tend vers V lorsque [] A augmente (§ 3.3) ; clairement, il est utile
de réaliser des mesures de v à des concentrations de [] A aussi élevées que le coût,
la solubilité ou toute autre contrainte (comme une absorbance élevée dans le cas
d’une mesure utilisant un spectromètre) le permettent. En principe, plus la
concentration [] A utilisée sera grande et meilleure sera la mesure, mais en réalité