4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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4.2. DÉTECTION DE L’INACTIVATION D’UN ENZYME
De nombreux enzymes sont plus stables à fortes concentrations qu’à faibles
concentrations, de sorte qu’il est courant qu’un enzyme perde rapidement son
activité lorsqu’il est dilué à partir d’une solution stock. Ceci peut évidemment
conduire à des erreurs dans l’estimation du niveau général d’activité, mais de
manière moins évidente, cela peut aussi conduire à de mauvaises appréciations du
type de comportement de l’enzyme. Il est courant qu’un complexe enzyme-substrat
soit plus stable que l’enzyme libre, et en conséquence les enzymes perdent souvent
plus lentement leur activité en présence de fortes concentrations de substrat. Si un
tel comportement n’est pas identifié, il peut être confondu avec un effet coopératif
(chapitre 9), puisqu’il se caractérise par des déviations de la vitesse initiale par
rapport aux cinétiques de MICHAELIS et MENTEN. Même si l’effet n’est pas aussi
sérieux, l’utilisation de conditions qui minimisent l’inactivation de l’enzyme sont
susceptibles de donner des résultats plus reproductibles et dans de nombreux cas, il
est utile de savoir si la diminution d’activité observée est entièrement ou
partiellement provoquée par une perte d’activité enzymatique (plutôt que par la
disparition du substrat ou par une inhibition par le produit). SELWYN (1965) a
décrit un test simple permettant d’éviter ce problème.
Il a montré qu’aussi longtemps que la vitesse dP d t
[] / reste proportionnelle à la
concentration initiale d’enzyme [] E 0 , cette vitesse peut être exprimée comme le
produit de la constante [] E 0 et d’une fonction dépendante des concentrations
instantanées de substrat, de produit, d’inhibiteur et de toute autre espèce (autre que
l’enzyme) qui peut être présente dans le mélange. Ces concentrations peuvent être
calculées à partir de la stœchiométrie de la réaction et de la concentration de [] P à
n’importe quel temps. Ainsi l’équation de vitesse peut être écrite sous une forme
simple :
dP
dt
EfP
[]
[ ] ([ ])
=
0
[4.9]
où f est une fonction qui peut en principe être dérivée à partir de l’équation de
vitesse. Le fait que f soit difficile à dériver ou que son expression soit compliquée
n’a pas d’importance, parce que la connaissance de la forme exacte de la fonction
n’est pas nécessaire. Il est seulement nécessaire de savoir qu’elle est indépendante
de [] E 0 et de t, et donc que la forme intégrée de l’équation [4.9] doit être
[ ]
([ ])
Et
FP
0
=
[4.10]
où F est une autre fonction. L’importance pratique de cette équation est qu’elle
montre que la valeur de [] Et 0 , après qu’une quantité donnée de produit se soit
formée, est indépendante de [] E 0 . En conséquence, si des courbes d’avancement
de réaction sont mesurées pour diverses valeurs de [] E 0 mais en maintenant
identique le reste des conditions, les graphiques de [] P en fonction de [] Et 0
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4.2. DÉTECTION DE L’INACTIVATION D’UN ENZYME
De nombreux enzymes sont plus stables à fortes concentrations qu’à faibles
concentrations, de sorte qu’il est courant qu’un enzyme perde rapidement son
activité lorsqu’il est dilué à partir d’une solution stock. Ceci peut évidemment
conduire à des erreurs dans l’estimation du niveau général d’activité, mais de
manière moins évidente, cela peut aussi conduire à de mauvaises appréciations du
type de comportement de l’enzyme. Il est courant qu’un complexe enzyme-substrat
soit plus stable que l’enzyme libre, et en conséquence les enzymes perdent souvent
plus lentement leur activité en présence de fortes concentrations de substrat. Si un
tel comportement n’est pas identifié, il peut être confondu avec un effet coopératif
(chapitre 9), puisqu’il se caractérise par des déviations de la vitesse initiale par
rapport aux cinétiques de MICHAELIS et MENTEN. Même si l’effet n’est pas aussi
sérieux, l’utilisation de conditions qui minimisent l’inactivation de l’enzyme sont
susceptibles de donner des résultats plus reproductibles et dans de nombreux cas, il
est utile de savoir si la diminution d’activité observée est entièrement ou
partiellement provoquée par une perte d’activité enzymatique (plutôt que par la
disparition du substrat ou par une inhibition par le produit). SELWYN (1965) a
décrit un test simple permettant d’éviter ce problème.
Il a montré qu’aussi longtemps que la vitesse dP d t
[] / reste proportionnelle à la
concentration initiale d’enzyme [] E 0 , cette vitesse peut être exprimée comme le
produit de la constante [] E 0 et d’une fonction dépendante des concentrations
instantanées de substrat, de produit, d’inhibiteur et de toute autre espèce (autre que
l’enzyme) qui peut être présente dans le mélange. Ces concentrations peuvent être
calculées à partir de la stœchiométrie de la réaction et de la concentration de [] P à
n’importe quel temps. Ainsi l’équation de vitesse peut être écrite sous une forme
simple :
dP
dt
EfP
[]
[ ] ([ ])
=
0
[4.9]
où f est une fonction qui peut en principe être dérivée à partir de l’équation de
vitesse. Le fait que f soit difficile à dériver ou que son expression soit compliquée
n’a pas d’importance, parce que la connaissance de la forme exacte de la fonction
n’est pas nécessaire. Il est seulement nécessaire de savoir qu’elle est indépendante
de [] E 0 et de t, et donc que la forme intégrée de l’équation [4.9] doit être
[ ]
([ ])
Et
FP
0
=
[4.10]
où F est une autre fonction. L’importance pratique de cette équation est qu’elle
montre que la valeur de [] Et 0 , après qu’une quantité donnée de produit se soit
formée, est indépendante de [] E 0 . En conséquence, si des courbes d’avancement
de réaction sont mesurées pour diverses valeurs de [] E 0 mais en maintenant
identique le reste des conditions, les graphiques de [] P en fonction de [] Et 0