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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
précédemment s’appliquent, mais en utilisant une définition plus stricte de l’état
stationnaire. A l’état stationnaire, la valeur de [] B dans le schéma considéré cidessus est obtenue en fixant v 1 = v 2 et en résolvant l’équation [4.4] pour [] B . Cette
approche donne [] B = (K m2 v 1 )/(V 2 – v 1 ) et permet de déterminer simplement
quelle doit être la valeur de V 2 pour que la valeur de [] B à l’état stationnaire ne
soit pas suffisamment élevée pour créer des problèmes.
Quelquefois, il est nécessaire de coupler une réaction avec deux ou plusieurs
enzymes. Par exemple, la mesure couplée mentionnée ci-dessus pour l’hexokinase
ne pourrait pas servir pour l’étude de l’inhibition de l’hexokinase par le glucose
6-phosphate parce que le système n’élimine pas uniquement le glucose 6-phosphate
généré par la réaction, mais aussi celui ajouté par l’expérimentateur. Dans ce cas, il
est nécessaire de coupler la production d’ADP à l’oxydation du NAD red en utilisant
deux enzymes, la pyruvate kinase et la lactate déshydrogénase :
ADP + Phosphoénolpyruvate
Pyruvate + ATP
[4.7]
Pyruvate + NAD red
Lactate + NAD ox
[4.8]
Une analyse rigoureuse des systèmes couplés impliquant deux ou plusieurs
enzymes est difficile mais, qualitativement, ils ressemblent au cas simple que nous
venons de considérer : il est nécessaire de s’assurer que l’activité des enzymes
couplées est suffisamment élevée pour que la vitesse mesurée atteigne 99% de la
vitesse nécessaire pendant la période durant laquelle la vitesse reste effectivement
constante. Ceci peut être facilement vérifié par l’expérience : si les concentrations
des systèmes couplés sont suffisamment élevées, il ne devrait y avoir aucun effet
sur la vitesse mesurée quand ces concentrations sont doublées, et la vitesse
observée devrait être proportionnelle à la concentration de l’enzyme étudié sur la
totalité de la gamme utilisée. Comme l’a discuté EASTERBY (1981), les temps
nécessaires pour que deux ou plusieurs enzymes couplés atteignent leur état
stationnaire, s’additionnent et il est ainsi possible d’estimer raisonnablement le
temps total nécessaire pour l’établissement d’un état stationnaire global.
Dans tous les cas, il existe des raisons autres que celle du coût financier pour ne
pas dépasser la concentration d’enzyme couplé strictement nécessaire pour réaliser
une mesure efficace. Sauf si l’enzyme couplé a été purifié de manière aussi
extensive que l’enzyme étudié, il y a toujours le risque que la préparation d’enzyme
couplé contienne des impuretés qui pourraient perturber la mesure, et même si
l’enzyme est pur, il peut avoir des activités parasites qu’il est souhaitable de
minimiser. Par exemple, la glucose 6-phosphate déshydrogénase catalyse la
réaction présentée dans l’équation [4.2], mais possède aussi une faible activité visà-vis du glucose. Des dangers potentiels du même type sont possibles avec tous les
systèmes couplés puisqu’un enzyme choisi de manière à agir sur un substrat peut
toujours avoir la capacité de réagir avec le produit.
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
précédemment s’appliquent, mais en utilisant une définition plus stricte de l’état
stationnaire. A l’état stationnaire, la valeur de [] B dans le schéma considéré cidessus est obtenue en fixant v 1 = v 2 et en résolvant l’équation [4.4] pour [] B . Cette
approche donne [] B = (K m2 v 1 )/(V 2 – v 1 ) et permet de déterminer simplement
quelle doit être la valeur de V 2 pour que la valeur de [] B à l’état stationnaire ne
soit pas suffisamment élevée pour créer des problèmes.
Quelquefois, il est nécessaire de coupler une réaction avec deux ou plusieurs
enzymes. Par exemple, la mesure couplée mentionnée ci-dessus pour l’hexokinase
ne pourrait pas servir pour l’étude de l’inhibition de l’hexokinase par le glucose
6-phosphate parce que le système n’élimine pas uniquement le glucose 6-phosphate
généré par la réaction, mais aussi celui ajouté par l’expérimentateur. Dans ce cas, il
est nécessaire de coupler la production d’ADP à l’oxydation du NAD red en utilisant
deux enzymes, la pyruvate kinase et la lactate déshydrogénase :
ADP + Phosphoénolpyruvate
Pyruvate + ATP
[4.7]
Pyruvate + NAD red
Lactate + NAD ox
[4.8]
Une analyse rigoureuse des systèmes couplés impliquant deux ou plusieurs
enzymes est difficile mais, qualitativement, ils ressemblent au cas simple que nous
venons de considérer : il est nécessaire de s’assurer que l’activité des enzymes
couplées est suffisamment élevée pour que la vitesse mesurée atteigne 99% de la
vitesse nécessaire pendant la période durant laquelle la vitesse reste effectivement
constante. Ceci peut être facilement vérifié par l’expérience : si les concentrations
des systèmes couplés sont suffisamment élevées, il ne devrait y avoir aucun effet
sur la vitesse mesurée quand ces concentrations sont doublées, et la vitesse
observée devrait être proportionnelle à la concentration de l’enzyme étudié sur la
totalité de la gamme utilisée. Comme l’a discuté EASTERBY (1981), les temps
nécessaires pour que deux ou plusieurs enzymes couplés atteignent leur état
stationnaire, s’additionnent et il est ainsi possible d’estimer raisonnablement le
temps total nécessaire pour l’établissement d’un état stationnaire global.
Dans tous les cas, il existe des raisons autres que celle du coût financier pour ne
pas dépasser la concentration d’enzyme couplé strictement nécessaire pour réaliser
une mesure efficace. Sauf si l’enzyme couplé a été purifié de manière aussi
extensive que l’enzyme étudié, il y a toujours le risque que la préparation d’enzyme
couplé contienne des impuretés qui pourraient perturber la mesure, et même si
l’enzyme est pur, il peut avoir des activités parasites qu’il est souhaitable de
minimiser. Par exemple, la glucose 6-phosphate déshydrogénase catalyse la
réaction présentée dans l’équation [4.2], mais possède aussi une faible activité visà-vis du glucose. Des dangers potentiels du même type sont possibles avec tous les
systèmes couplés puisqu’un enzyme choisi de manière à agir sur un substrat peut
toujours avoir la capacité de réagir avec le produit.