4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
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derniers moments de la réaction ne sont pas utilisés dans la détermination de la
vitesse, leur présence dans la courbe réduira la probabilité d’erreur due au
traitement d’une partie de la courbe comme si elle était linéaire, c’est-à-dire que
cela permettra de réduire la probabilité d’une erreur similaire à celle présentée dans
la figure 4.1.
4.1.4. Les systèmes couplés
Lorsque la réaction étudiée ne donne pas lieu à un signal spectroscopique facilement mesurable, il est parfois possible de suivre la réaction de manière indirecte en
la « couplant » à une autre réaction. Considérons, par exemple, la réaction de
transfert d’un groupe phosphate à partir de l’ATP vers le glucose, catalysée par
l’hexokinase :
Glucose + ATP
Glucose 6-phosphate + ADP
[4.1]
Cette réaction ne s’accompagne d’aucun changement spectral utilisable, mais elle
peut être suivie par spectrophotométrie, en la couplant à la réaction catalysée par la
glucose 6-phosphate déshydrogénase :
Glucose 6-phosphate + NADP ox
6-phosphogluconate + NADP red [4.2]
Si l’activité de l’enzyme couplée est suffisamment élevée pour que le glucose
6-phosphate soit oxydé aussi vite qu’il se forme, la conversion du NAD ox en
NAD red , enregistrée à l’aide d’un spectrophotomètre, se déroulera exactement à la
même vitesse que la première réaction. Les conditions nécessaires pour que le
système couplé soit utilisable, peuvent être exprimées dans des termes simples
mais généraux en utilisant le schéma suivant :
v 1
v 2
A
B
C
[4.3]
[ ]
A
[] B[ ]
C
dans lequel la conversion de A en B à la vitesse v 1 est la réaction étudiée, et la
conversion de B en C est la réaction couplée qui se déroule à la vitesse v 2 et qui
peut facilement être suivie expérimentalement. Evidement les mesures de v 2 fourniront une information précise sur la valeur initiale de la vitesse v 1 uniquement si un
état stationnaire pour la concentration de B est atteint avant que v 1 ne commence à
diminuer perceptiblement par rapport à sa valeur initiale. La plupart des traitements
de ce système (par exemple celui de MC CLURE, 1969) supposent que v 2 ait une
dépendance du premier ordre vis-à-vis de [] B , bien que cette condition soit
irréaliste, ne soit pas nécessaire et puisse même conduire à un gaspillage de
matériel. Puisque la réaction couplée est généralement catalysée par un enzyme, il
est plus approprié de supposer que v 2 dépende de [] B en accord avec l’équation de
MICHAELIS et MENTEN :
v
VB
KB m
2
2
2
=
+
[]
[]
[4.4]
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derniers moments de la réaction ne sont pas utilisés dans la détermination de la
vitesse, leur présence dans la courbe réduira la probabilité d’erreur due au
traitement d’une partie de la courbe comme si elle était linéaire, c’est-à-dire que
cela permettra de réduire la probabilité d’une erreur similaire à celle présentée dans
la figure 4.1.
4.1.4. Les systèmes couplés
Lorsque la réaction étudiée ne donne pas lieu à un signal spectroscopique facilement mesurable, il est parfois possible de suivre la réaction de manière indirecte en
la « couplant » à une autre réaction. Considérons, par exemple, la réaction de
transfert d’un groupe phosphate à partir de l’ATP vers le glucose, catalysée par
l’hexokinase :
Glucose + ATP
Glucose 6-phosphate + ADP
[4.1]
Cette réaction ne s’accompagne d’aucun changement spectral utilisable, mais elle
peut être suivie par spectrophotométrie, en la couplant à la réaction catalysée par la
glucose 6-phosphate déshydrogénase :
Glucose 6-phosphate + NADP ox
6-phosphogluconate + NADP red [4.2]
Si l’activité de l’enzyme couplée est suffisamment élevée pour que le glucose
6-phosphate soit oxydé aussi vite qu’il se forme, la conversion du NAD ox en
NAD red , enregistrée à l’aide d’un spectrophotomètre, se déroulera exactement à la
même vitesse que la première réaction. Les conditions nécessaires pour que le
système couplé soit utilisable, peuvent être exprimées dans des termes simples
mais généraux en utilisant le schéma suivant :
v 1
v 2
A
B
C
[4.3]
[ ]
A
[] B[ ]
C
dans lequel la conversion de A en B à la vitesse v 1 est la réaction étudiée, et la
conversion de B en C est la réaction couplée qui se déroule à la vitesse v 2 et qui
peut facilement être suivie expérimentalement. Evidement les mesures de v 2 fourniront une information précise sur la valeur initiale de la vitesse v 1 uniquement si un
état stationnaire pour la concentration de B est atteint avant que v 1 ne commence à
diminuer perceptiblement par rapport à sa valeur initiale. La plupart des traitements
de ce système (par exemple celui de MC CLURE, 1969) supposent que v 2 ait une
dépendance du premier ordre vis-à-vis de [] B , bien que cette condition soit
irréaliste, ne soit pas nécessaire et puisse même conduire à un gaspillage de
matériel. Puisque la réaction couplée est généralement catalysée par un enzyme, il
est plus approprié de supposer que v 2 dépende de [] B en accord avec l’équation de
MICHAELIS et MENTEN :
v
VB
KB m
2
2
2
=
+
[]
[]
[4.4]