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CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
moment auquel débute l’observation de la réaction (temps mort de la méthode),
c’est-à-dire de réduire la fraction de la réaction qui n’est pas directement
observable.
Par contre, il est possible d’améliorer la linéarité de la courbe d’avancement de la
réaction en augmentant la concentration de substrat, à condition que les produits ne
se lient pas plus fortement que les substrats à l’enzyme (comme c’est souvent le
cas, par exemple, avec les réactions dans lesquelles le NAD ox est converti en
NAD red ). Pour illustrer l’effet de la concentration de substrat, nous considérerons le
cas le plus simple, celui d’une réaction qui obéit à l’équation de MICHAELIS et
MENTEN et n’est sensible ni à une inhibition par le produit de la réaction ni à un
ralentissement causé par un phénomène autre que la disparition du substrat. Dans
ce cas, la forme intégrée de l’équation de MICHAELIS et MENTEN (c’est-à-dire
l’équation [2.56], avec VV
app
= et KK m
app
m
=
) décrit la courbe d’avancement de la
réaction. Si la concentration initiale de substrat [] A 0 est égale à 5 K m , la vitesse
initiale v 0 est égale à 0,83 V et est largement insensible à une légère erreur dans la
concentration de substrat [] A 0 . Même si la valeur de [] A 0 est augmentée jusqu’à
10 K m , v 0 augmente seulement de 9%, jusqu’à 0,92 V. A priori, ces considérations
suggèrent que l’augmentation de la concentration de substrat n’apporte aucune
amélioration appréciable à la mesure, en dépit du fait qu’elle coûte plus chère,
puisqu’elle nécessite une plus grande quantité de substrat. Cependant un calcul
simple utilisant l’équation [2.56] montre que si [] A 0 = 5 K m , le temps nécessaire
pour que la vitesse diminue de 1% est de 0,34 K m /V, alors que si [] A 0 = 10 K m le
temps nécessaire pour obtenir le même ralentissement est de 1,11 K m /V, c’est-àdire un temps 3 fois plus long. Ainsi, une augmentation de la concentration initiale
de substrat étend la zone « linéaire ». En pratique ce calcul est une simplification,
parce que quasiment toutes les réactions catalysées par des enzymes sont sujettes à
une inhibition par le produit, mais le principe continue à s’appliquer qualitativement même si les produits se fixent plus fortement sur l’enzyme que les substrats.
Une seconde raison d’utiliser une concentration de substrat aussi élevée que
possible dans un test enzymatique, dans les limites permises par le coût, la
solubilité et l’inhibition par le produit, est que cette pratique minimise la sensibilité
du test aux erreurs commises sur la concentration du substrat, non seulement au
cours de la réaction comme nous venons d’en discuter, mais aussi d’une expérience
à l’autre. Dans le cas où [] A 0 = 0,1 K m , par exemple, les solutions devraient être
préparées avec infiniment de précision, car une erreur de 10% commise sur la
concentration de substrat ( [] A 0 ) se traduit par une erreur d’environ 10% sur la
valeur mesurée de la vitesse ; inversement, dans le cas où [] A 0 = 10 K m , une
précision moindre serait exigée dans la préparation des solutions, puisqu’une erreur
de 10% commise sur [] A 0 se traduit par une erreur inférieure à 1% sur la mesure
de la vitesse. Si des précautions sont prises pour augmenter la linéarité de la courbe
d’avancement de la réaction, il est toujours recommandé d’observer la réaction
suffisamment longtemps pour que la courbure devienne visible. Même si ces
CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
moment auquel débute l’observation de la réaction (temps mort de la méthode),
c’est-à-dire de réduire la fraction de la réaction qui n’est pas directement
observable.
Par contre, il est possible d’améliorer la linéarité de la courbe d’avancement de la
réaction en augmentant la concentration de substrat, à condition que les produits ne
se lient pas plus fortement que les substrats à l’enzyme (comme c’est souvent le
cas, par exemple, avec les réactions dans lesquelles le NAD ox est converti en
NAD red ). Pour illustrer l’effet de la concentration de substrat, nous considérerons le
cas le plus simple, celui d’une réaction qui obéit à l’équation de MICHAELIS et
MENTEN et n’est sensible ni à une inhibition par le produit de la réaction ni à un
ralentissement causé par un phénomène autre que la disparition du substrat. Dans
ce cas, la forme intégrée de l’équation de MICHAELIS et MENTEN (c’est-à-dire
l’équation [2.56], avec VV
app
= et KK m
app
m
=
) décrit la courbe d’avancement de la
réaction. Si la concentration initiale de substrat [] A 0 est égale à 5 K m , la vitesse
initiale v 0 est égale à 0,83 V et est largement insensible à une légère erreur dans la
concentration de substrat [] A 0 . Même si la valeur de [] A 0 est augmentée jusqu’à
10 K m , v 0 augmente seulement de 9%, jusqu’à 0,92 V. A priori, ces considérations
suggèrent que l’augmentation de la concentration de substrat n’apporte aucune
amélioration appréciable à la mesure, en dépit du fait qu’elle coûte plus chère,
puisqu’elle nécessite une plus grande quantité de substrat. Cependant un calcul
simple utilisant l’équation [2.56] montre que si [] A 0 = 5 K m , le temps nécessaire
pour que la vitesse diminue de 1% est de 0,34 K m /V, alors que si [] A 0 = 10 K m le
temps nécessaire pour obtenir le même ralentissement est de 1,11 K m /V, c’est-àdire un temps 3 fois plus long. Ainsi, une augmentation de la concentration initiale
de substrat étend la zone « linéaire ». En pratique ce calcul est une simplification,
parce que quasiment toutes les réactions catalysées par des enzymes sont sujettes à
une inhibition par le produit, mais le principe continue à s’appliquer qualitativement même si les produits se fixent plus fortement sur l’enzyme que les substrats.
Une seconde raison d’utiliser une concentration de substrat aussi élevée que
possible dans un test enzymatique, dans les limites permises par le coût, la
solubilité et l’inhibition par le produit, est que cette pratique minimise la sensibilité
du test aux erreurs commises sur la concentration du substrat, non seulement au
cours de la réaction comme nous venons d’en discuter, mais aussi d’une expérience
à l’autre. Dans le cas où [] A 0 = 0,1 K m , par exemple, les solutions devraient être
préparées avec infiniment de précision, car une erreur de 10% commise sur la
concentration de substrat ( [] A 0 ) se traduit par une erreur d’environ 10% sur la
valeur mesurée de la vitesse ; inversement, dans le cas où [] A 0 = 10 K m , une
précision moindre serait exigée dans la préparation des solutions, puisqu’une erreur
de 10% commise sur [] A 0 se traduit par une erreur inférieure à 1% sur la mesure
de la vitesse. Si des précautions sont prises pour augmenter la linéarité de la courbe
d’avancement de la réaction, il est toujours recommandé d’observer la réaction
suffisamment longtemps pour que la courbure devienne visible. Même si ces