Matériel et méthodes
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III.6. Détection des béta-lactamases à spectre élargi (BLSE)
La production d’une BLSE peut être détectée par la mise en évidence d'une synergie entre
des céphalosporines de 3
ème
ou 4
ème
génération (céfotaxime, ceftazidime, céfépime) et un
inhibiteur de cette enzyme tel que l’acide clavulanique. Les disques des antibiotiques
indicateurs et celui de l'inhibiteur (ex. amoxilline+clavulanate, AMC) sont déposés à une
distance de 30 mm. La présence d’une BLSE se traduit par l’apparition d’une image de
synergie du côté de l’inhibiteur. Toutefois, si les isolats testés sont aussi producteurs
d’autres mécanismes de résistance aux β-lactamines comme l’hyperproduction de
céphalosporinase, la détection de l’image de synergie peut être facilitée par la réalisation
du test en présence de la cloxacilline (250 mg/l) qui est un inhibiteur de la
céphalosporinase (Jarlieret al., 1988; Vedel, 1997).
III.7. Transfert génétique par conjugaison bactérienne en milieu solide
A partir de cultures de 18 heures sur bouillon Brain Heart Infusion Agar (BHIB), un
volume de la souche donatrice et deux volumes de la souche réceptrice sont mélangés et
centrifugés à 12000 rpm pendant 2 minutes. Le culot est remis en suspension dans 100 µl
d’eau physiologique stérile, lesquelles sont utilisées pour l'ensemencement d'une gélose
Mueller Hinton à l'aide de spot de 20 µl. Après une incubation de 24 h à 37°C, la culture
mixte est mise en suspension dans de l’eau physiologique stérile et ensemencé sur une
gélose de Mueller Hinton supplémentée d'Azide de Sodium (250 μg/ml) et de l'un des
antibiotiques, céfotaxime (2 μg/ml) ou amoxicilline (8 μg/ml), ou céfoxitine (8 μg/ml) ou
imipénème (8 μg/ml). Après incubation à 37°C pendant 24 h, les souches réceptrices ayant
acquis le caractère de résistance à l'un des antibiotiques (clones transconjugants) sont
réisolées à partir des boîtes de sélection. Les transconjugants sont analysés par
antibiogramme pour déterminer leur profils de résistance (Bakour et al., 1983; Courvalin et
al., 1985).
III.8. Extraction de l'ADN total bactérien
L'ADN a été extrait selon la méthode de Feria et al. (2002). A partir d'une culture de 18h
sur gélose MH, 4 à 5 colonies bactériennes sont mises en suspension dans 200 μl d'eau
distillée stérile qui sont porté à ébullition pendant 10 min. Le lysat obtenu est ensuite
centrifugé à 12000 tours/minute à 4°C pendant 2 min et le surnagent contenant l'ADN est
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III.6. Détection des béta-lactamases à spectre élargi (BLSE)
La production d’une BLSE peut être détectée par la mise en évidence d'une synergie entre
des céphalosporines de 3
ème
ou 4
ème
génération (céfotaxime, ceftazidime, céfépime) et un
inhibiteur de cette enzyme tel que l’acide clavulanique. Les disques des antibiotiques
indicateurs et celui de l'inhibiteur (ex. amoxilline+clavulanate, AMC) sont déposés à une
distance de 30 mm. La présence d’une BLSE se traduit par l’apparition d’une image de
synergie du côté de l’inhibiteur. Toutefois, si les isolats testés sont aussi producteurs
d’autres mécanismes de résistance aux β-lactamines comme l’hyperproduction de
céphalosporinase, la détection de l’image de synergie peut être facilitée par la réalisation
du test en présence de la cloxacilline (250 mg/l) qui est un inhibiteur de la
céphalosporinase (Jarlieret al., 1988; Vedel, 1997).
III.7. Transfert génétique par conjugaison bactérienne en milieu solide
A partir de cultures de 18 heures sur bouillon Brain Heart Infusion Agar (BHIB), un
volume de la souche donatrice et deux volumes de la souche réceptrice sont mélangés et
centrifugés à 12000 rpm pendant 2 minutes. Le culot est remis en suspension dans 100 µl
d’eau physiologique stérile, lesquelles sont utilisées pour l'ensemencement d'une gélose
Mueller Hinton à l'aide de spot de 20 µl. Après une incubation de 24 h à 37°C, la culture
mixte est mise en suspension dans de l’eau physiologique stérile et ensemencé sur une
gélose de Mueller Hinton supplémentée d'Azide de Sodium (250 μg/ml) et de l'un des
antibiotiques, céfotaxime (2 μg/ml) ou amoxicilline (8 μg/ml), ou céfoxitine (8 μg/ml) ou
imipénème (8 μg/ml). Après incubation à 37°C pendant 24 h, les souches réceptrices ayant
acquis le caractère de résistance à l'un des antibiotiques (clones transconjugants) sont
réisolées à partir des boîtes de sélection. Les transconjugants sont analysés par
antibiogramme pour déterminer leur profils de résistance (Bakour et al., 1983; Courvalin et
al., 1985).
III.8. Extraction de l'ADN total bactérien
L'ADN a été extrait selon la méthode de Feria et al. (2002). A partir d'une culture de 18h
sur gélose MH, 4 à 5 colonies bactériennes sont mises en suspension dans 200 μl d'eau
distillée stérile qui sont porté à ébullition pendant 10 min. Le lysat obtenu est ensuite
centrifugé à 12000 tours/minute à 4°C pendant 2 min et le surnagent contenant l'ADN est