__________________________________________ CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
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II.2.5.1.3 Test de la résistance au pH gastrique
Après revivification des souches tests, 1 ml a été suspendue dans une solution de MRS bouillon
ajusté à pH 2, pH 3 et pH 4, et incubés à 37°C. (El-JENI et al. 2015)
Après 3h d’incubation le taux de survie des bactéries dans le bouillon d’MRS acide est estimé
par un dénombrement en surface. (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN, 2015)
II.2.5.1.4 Test de la résistance aux sels biliaires
Après une revivification des souches tests, 1 ml a été suspendue dans une solution de MRS
bouillon ajusté à pH 8 avec une concentration d’OXGAL de 0.5% et incubés à 37°C. (El-JENI
et al. 2015)
Après 3h d’incubation dans les sels biliaires le taux de survie des bactéries dans le bouillon
d’MRS est estimé par un dénombrement en surface (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN,
2015)
II.2.5.1.5 Test de la production de biofilm
Une culture bactérienne de 18h à 37°C, est vortexée pendant 5min, ajusté à une densité optique
entre 0.56 – 0.64 à une longueur d’onde de 540 nm. Un volume de 250µl de chaque suspension
est incubé sur les plaques de 96 puits stériles pendant 6h à 37°C, après incubation chaque puits
reçoit un volume de 25µl de cristal violet à 1% , ensuite 15 min d’incubation , chaque puits est
lavé trois fois avec 200 µl de PBS stérile , les puits seront par la suite lavés deux fois avec un
volume de 200µl d’éthyle alcool .le contenu inoculum est introduit dans un tube à essai
contenant un volume de 1.2 ml d’alcool , après une simple agitation la DO est mesurée à une
longueur d’onde de 540 nm. Les souches bactériennes sont quantifiées forts producteurs si la DO
est supérieur à 0,500, des producteurs moyens si la DO est entre 0.500 et 0.100 et des faibles
producteurs si la DO est inférieure à 0.100 (MALDONADO et al. 2007).
II.2.5.2.Tests de Biosécurité
II.2.5.2.1.Test d’anti bio-résistance
Les bactéries isolées sur MRS et M17 ont été testées vis-à-vis de 8 disques antibiotiques : les
inhibiteurs de la paroi bactérienne : penicillin (10 µg), oxacillin (1µg), vancomycin (30µg) ; les
inhibiteurs de la synthèse protéique : Gentamycin (10µg), chloramphenicol (30µg), tetracyclin
(30 µg), streptomycin (10µg), clindomycin (2µg). Pour réaliser ce test, les souches ont été
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II.2.5.1.3 Test de la résistance au pH gastrique
Après revivification des souches tests, 1 ml a été suspendue dans une solution de MRS bouillon
ajusté à pH 2, pH 3 et pH 4, et incubés à 37°C. (El-JENI et al. 2015)
Après 3h d’incubation le taux de survie des bactéries dans le bouillon d’MRS acide est estimé
par un dénombrement en surface. (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN, 2015)
II.2.5.1.4 Test de la résistance aux sels biliaires
Après une revivification des souches tests, 1 ml a été suspendue dans une solution de MRS
bouillon ajusté à pH 8 avec une concentration d’OXGAL de 0.5% et incubés à 37°C. (El-JENI
et al. 2015)
Après 3h d’incubation dans les sels biliaires le taux de survie des bactéries dans le bouillon
d’MRS est estimé par un dénombrement en surface (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN,
2015)
II.2.5.1.5 Test de la production de biofilm
Une culture bactérienne de 18h à 37°C, est vortexée pendant 5min, ajusté à une densité optique
entre 0.56 – 0.64 à une longueur d’onde de 540 nm. Un volume de 250µl de chaque suspension
est incubé sur les plaques de 96 puits stériles pendant 6h à 37°C, après incubation chaque puits
reçoit un volume de 25µl de cristal violet à 1% , ensuite 15 min d’incubation , chaque puits est
lavé trois fois avec 200 µl de PBS stérile , les puits seront par la suite lavés deux fois avec un
volume de 200µl d’éthyle alcool .le contenu inoculum est introduit dans un tube à essai
contenant un volume de 1.2 ml d’alcool , après une simple agitation la DO est mesurée à une
longueur d’onde de 540 nm. Les souches bactériennes sont quantifiées forts producteurs si la DO
est supérieur à 0,500, des producteurs moyens si la DO est entre 0.500 et 0.100 et des faibles
producteurs si la DO est inférieure à 0.100 (MALDONADO et al. 2007).
II.2.5.2.Tests de Biosécurité
II.2.5.2.1.Test d’anti bio-résistance
Les bactéries isolées sur MRS et M17 ont été testées vis-à-vis de 8 disques antibiotiques : les
inhibiteurs de la paroi bactérienne : penicillin (10 µg), oxacillin (1µg), vancomycin (30µg) ; les
inhibiteurs de la synthèse protéique : Gentamycin (10µg), chloramphenicol (30µg), tetracyclin
(30 µg), streptomycin (10µg), clindomycin (2µg). Pour réaliser ce test, les souches ont été