Chapitre II
MATERIEL ET METHODES
28
II.6.4 Oursins, moules et huîtres
Avant son ouverture (oursin, moule, huître), la coquille a été soigneusement lavée et décontaminée
au moyen d'une gaze stérile imprégnée avec de l’alcool à 70%, puis rincée à l'eau distillée stérile.
Les coquillages sont ensuite ouverts dans une atmosphère stérile et la chair a été récupérée. Cette
dernière, a été tout d’abord, lavée au moyen d'eau de mer stérile afin d'éliminer l'eau inter-valvaire
qui pourrait contenir des spores, puis les chairs ont été broyées dans de l'eau de mer stérile. Le
broyat a ensuite été centrifugé à 2500 (tours) min
-1 pendant 15 min et le surnageant a été ensemencé
sur la gélose comme pour les autres types de prélèvements, comme pour les sédiments, le volume
étalé a été à 1 ml par boîte.
Toutes les boîtes de Pétri ont été incubées à 25°C, pendant 7 jours, avec un suivi hebdomadaire.
Repiquage et purification des souches
Des observations quotidiennes qui ont été effectuées afin de poursuivre le développement radiales
des colonies fongiques, et enfin décrire l’ensemble des caractéristiques culturelles et
morphologiques.
Pour obtenir des isolats purs, des observations quotidiennes ont été effectuées dès l’apparition des
colonies fongiques filamenteuses.
Une mycoflore variée s’est développée, chaque isolat développé a été repiqué, le repiquage consiste
à prélever un fragment mycélien, à la marge du thalle de chaque colonie fongique
morphologiquement distincte à l’aide d’une anse de platine stérile et de le transférer au centre d’une
boîte de Pétri de 9 cm Ø contenant le milieu PDA plus un antibiotique : le chloramphénicol, à une
concentration de 50 mg/l, en vue d’éviter la prolifération bactérienne qui pourrait inhiber ou gêner
celle des champignons, avec quelques gouttes de tween 80 pour mettre les spores en suspension.
Après cette opération, les boîtes sont entourées de parafilm et sont mises à incuber à une
température de 25°C pendant 7 jours et plus, jusqu’à l’envahissement total de la surface de la
gélose.
En cas de contamination par autres souches fongiques, la purification des souches est effectuée par
le repiquage successif des souches sur le même milieu jusqu’à l’obtention des souches pures (Cf.
Figure 18 -page 29).
MATERIEL ET METHODES
28
II.6.4 Oursins, moules et huîtres
Avant son ouverture (oursin, moule, huître), la coquille a été soigneusement lavée et décontaminée
au moyen d'une gaze stérile imprégnée avec de l’alcool à 70%, puis rincée à l'eau distillée stérile.
Les coquillages sont ensuite ouverts dans une atmosphère stérile et la chair a été récupérée. Cette
dernière, a été tout d’abord, lavée au moyen d'eau de mer stérile afin d'éliminer l'eau inter-valvaire
qui pourrait contenir des spores, puis les chairs ont été broyées dans de l'eau de mer stérile. Le
broyat a ensuite été centrifugé à 2500 (tours) min
-1 pendant 15 min et le surnageant a été ensemencé
sur la gélose comme pour les autres types de prélèvements, comme pour les sédiments, le volume
étalé a été à 1 ml par boîte.
Toutes les boîtes de Pétri ont été incubées à 25°C, pendant 7 jours, avec un suivi hebdomadaire.
Repiquage et purification des souches
Des observations quotidiennes qui ont été effectuées afin de poursuivre le développement radiales
des colonies fongiques, et enfin décrire l’ensemble des caractéristiques culturelles et
morphologiques.
Pour obtenir des isolats purs, des observations quotidiennes ont été effectuées dès l’apparition des
colonies fongiques filamenteuses.
Une mycoflore variée s’est développée, chaque isolat développé a été repiqué, le repiquage consiste
à prélever un fragment mycélien, à la marge du thalle de chaque colonie fongique
morphologiquement distincte à l’aide d’une anse de platine stérile et de le transférer au centre d’une
boîte de Pétri de 9 cm Ø contenant le milieu PDA plus un antibiotique : le chloramphénicol, à une
concentration de 50 mg/l, en vue d’éviter la prolifération bactérienne qui pourrait inhiber ou gêner
celle des champignons, avec quelques gouttes de tween 80 pour mettre les spores en suspension.
Après cette opération, les boîtes sont entourées de parafilm et sont mises à incuber à une
température de 25°C pendant 7 jours et plus, jusqu’à l’envahissement total de la surface de la
gélose.
En cas de contamination par autres souches fongiques, la purification des souches est effectuée par
le repiquage successif des souches sur le même milieu jusqu’à l’obtention des souches pures (Cf.
Figure 18 -page 29).