Chapitre II
MATERIEL ET METHODES
27
On utilisant l’eau de mer stérile (autoclavée 3 fois) pour se rapprocher des conditions du milieu
naturel pour la préparation des milieux de culture.
Les milieux de culture sont répartis dans des flacons de 200 ml et stérilisés par autoclavage à 120°C
pendant 15 min.
À leur sortie de l’autoclave et avant leur coulage dans les boîtes de Pétrie, nous additionnons 3
gouttes (0,05ml) de tween80 comme agent tensioactif et 10 gouttes d’antibiotique à 50 mg
d’amoxicilline afin d’inhiber le développement bactérien.
II.6 Mise en culture des échantillons
Avant d’entamer le travail, il est important de créer une zone stérile, par la flamme du bec Bunsen,
sur une paillasse soigneusement nettoyée.
Les techniques de mise en culture varient selon le type d’échantillon.
II.6.1 Eau de mer
5ml d’eau de mer sont étalés sur la surface du milieu Rose Bengale dans des boîtes de Pétrie de 90
mm, à l’aide d’une pipette Pasteur incurvée en râteau. On utilise 2 boîtes de Pétrie pour chaque
station.
II.6.2 Sédiment de profondeur (Sp)
La solution mère est préparée en mélangeant 1g de Sp avec 49 ml d’eau de mer stérile, quelques
gouttes de tween80 sont ajoutées pour mettre toutes les spores en suspension selon les étapes
suivantes :
- Homogénéiser la solution mère par agitation du flacon de prélèvement pendant 10 min sur un
agitateur magnétique. La suspension obtenue correspond à la solution mère (1
ière dilution)
- Procéder tout d’abord à la numérotation des tubes en les étiquetant respectivement pour les
différentes dilutions.
- Prélever à l’aide d’une pipette graduée, 1ml de la solution mère à 9 ml d’eau de mer stérile dans
un tube à essai, c’est la deuxième dilution décimale.
- Prélever 1ml de la suspension de la deuxième dilution, avec une pipette Pasteur stérile et
transvaser dans un second tube à essai contenant 9ml d’eau de mer stérile, pour arriver à la
troisième dilution.
À l'aide d’une pipette stérile, 0.5ml de chaque dilution est étalée sur le milieu Rose Bengale avec 2
répétitions et une seule fois sur le milieu Cz. Les tubes ensemencés correspondent aux dilutions
décimales.
II.6.3 Débris
Chaque débris (bouchon, polyester, bois) flottant en surface est mis dans un flacon contenant 49 ml
d’eau de mer stérile, deux gouttes de tween80 sont ajoutées, l’ensemble est bien vortexé avec une
pipette stérile, 0.5 ml de chaque suspension est étalée sur le milieu Rose Bengale avec deux
répétitions, et une seule fois sur milieu Cz.
MATERIEL ET METHODES
27
On utilisant l’eau de mer stérile (autoclavée 3 fois) pour se rapprocher des conditions du milieu
naturel pour la préparation des milieux de culture.
Les milieux de culture sont répartis dans des flacons de 200 ml et stérilisés par autoclavage à 120°C
pendant 15 min.
À leur sortie de l’autoclave et avant leur coulage dans les boîtes de Pétrie, nous additionnons 3
gouttes (0,05ml) de tween80 comme agent tensioactif et 10 gouttes d’antibiotique à 50 mg
d’amoxicilline afin d’inhiber le développement bactérien.
II.6 Mise en culture des échantillons
Avant d’entamer le travail, il est important de créer une zone stérile, par la flamme du bec Bunsen,
sur une paillasse soigneusement nettoyée.
Les techniques de mise en culture varient selon le type d’échantillon.
II.6.1 Eau de mer
5ml d’eau de mer sont étalés sur la surface du milieu Rose Bengale dans des boîtes de Pétrie de 90
mm, à l’aide d’une pipette Pasteur incurvée en râteau. On utilise 2 boîtes de Pétrie pour chaque
station.
II.6.2 Sédiment de profondeur (Sp)
La solution mère est préparée en mélangeant 1g de Sp avec 49 ml d’eau de mer stérile, quelques
gouttes de tween80 sont ajoutées pour mettre toutes les spores en suspension selon les étapes
suivantes :
- Homogénéiser la solution mère par agitation du flacon de prélèvement pendant 10 min sur un
agitateur magnétique. La suspension obtenue correspond à la solution mère (1
ière dilution)
- Procéder tout d’abord à la numérotation des tubes en les étiquetant respectivement pour les
différentes dilutions.
- Prélever à l’aide d’une pipette graduée, 1ml de la solution mère à 9 ml d’eau de mer stérile dans
un tube à essai, c’est la deuxième dilution décimale.
- Prélever 1ml de la suspension de la deuxième dilution, avec une pipette Pasteur stérile et
transvaser dans un second tube à essai contenant 9ml d’eau de mer stérile, pour arriver à la
troisième dilution.
À l'aide d’une pipette stérile, 0.5ml de chaque dilution est étalée sur le milieu Rose Bengale avec 2
répétitions et une seule fois sur le milieu Cz. Les tubes ensemencés correspondent aux dilutions
décimales.
II.6.3 Débris
Chaque débris (bouchon, polyester, bois) flottant en surface est mis dans un flacon contenant 49 ml
d’eau de mer stérile, deux gouttes de tween80 sont ajoutées, l’ensemble est bien vortexé avec une
pipette stérile, 0.5 ml de chaque suspension est étalée sur le milieu Rose Bengale avec deux
répétitions, et une seule fois sur milieu Cz.