Chapitre II :
Matériel et méthodes
41
IV.5. Recherche et dénombrement des salmonelles (Norme ISO 6579-1 :2017)
La recherche de Salmonella nécessite quatre phases successives : pré-enrichissement,
enrichissement, isolement et confirmation biochimique.
IV.5.1. Pré enrichissement non sélectif
Les Salmonella peuvent être présentes en petit nombre. Un pré enrichissement est nécessaire
pour permettre la détection des Salmonella en nombre restreint ou des Salmonella stressées.
Pour la préparation de la suspension mère, 25 g de chair de poisson broyé et pesé à l’aide
d’une balance de précision est mélangé à 225 ml d’eau peptonée tamponnée. La suspension
mère est l’incubée entre 34 °C et 38 °C pendant 18 ± 2 h.
IV.5.2. Enrichissement sélectif
Transférer à l’aide d’une pipette graduée 0,1 ml et 1 ml de la suspension mère dans deux
tubes à essai contentant respectivement, 10 ml du bouillon Rappaport-Vassiliadis avec soja
(RVS) et un tube contenant 10 ml de bouillon Müller-Kauffmann tétrathionate-novobiocine
(MKTTn). Les tubes sont ensuite incubés comme suite : le bouillon RVS ensemencé à 41,5
°C pendant 24 h ± 3 h et le bouillon MKTTn ensemencé à 37 °C pendant 24 h ± 3 h.
IV.5.3. Isolement
À partir de la culture obtenue dans le bouillon RVS, ensemencer à l’aide d’une anse de 10 μl
sur la surface d’une boîte de Pétri stériles dans lesquelles on a préalablement coulé le milieu
gélosé d’isolement sélectif qui est une gélose xylose-lysine-désoxycholate (XLD. Procéder de
la même manière pour de la culture obtenue dans le bouillon MKTTn. Incuber les boîtes de
géloses XLD surface de la gélose vers le bas à 37 °C pendant 24 h ± 3 h.
Les colonies caractéristiques de Salmonella cultivées sur gélose XLD ont un centre noir et
sont entourées d’un halo clair rouge légèrement transparent dû à un changement de
l’indicateur du milieu. Les colonies caractéristiques sont isolées sur gélose nutritive puis
mises en cultures à 37°C pendant 24 heures.
Matériel et méthodes
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IV.5. Recherche et dénombrement des salmonelles (Norme ISO 6579-1 :2017)
La recherche de Salmonella nécessite quatre phases successives : pré-enrichissement,
enrichissement, isolement et confirmation biochimique.
IV.5.1. Pré enrichissement non sélectif
Les Salmonella peuvent être présentes en petit nombre. Un pré enrichissement est nécessaire
pour permettre la détection des Salmonella en nombre restreint ou des Salmonella stressées.
Pour la préparation de la suspension mère, 25 g de chair de poisson broyé et pesé à l’aide
d’une balance de précision est mélangé à 225 ml d’eau peptonée tamponnée. La suspension
mère est l’incubée entre 34 °C et 38 °C pendant 18 ± 2 h.
IV.5.2. Enrichissement sélectif
Transférer à l’aide d’une pipette graduée 0,1 ml et 1 ml de la suspension mère dans deux
tubes à essai contentant respectivement, 10 ml du bouillon Rappaport-Vassiliadis avec soja
(RVS) et un tube contenant 10 ml de bouillon Müller-Kauffmann tétrathionate-novobiocine
(MKTTn). Les tubes sont ensuite incubés comme suite : le bouillon RVS ensemencé à 41,5
°C pendant 24 h ± 3 h et le bouillon MKTTn ensemencé à 37 °C pendant 24 h ± 3 h.
IV.5.3. Isolement
À partir de la culture obtenue dans le bouillon RVS, ensemencer à l’aide d’une anse de 10 μl
sur la surface d’une boîte de Pétri stériles dans lesquelles on a préalablement coulé le milieu
gélosé d’isolement sélectif qui est une gélose xylose-lysine-désoxycholate (XLD. Procéder de
la même manière pour de la culture obtenue dans le bouillon MKTTn. Incuber les boîtes de
géloses XLD surface de la gélose vers le bas à 37 °C pendant 24 h ± 3 h.
Les colonies caractéristiques de Salmonella cultivées sur gélose XLD ont un centre noir et
sont entourées d’un halo clair rouge légèrement transparent dû à un changement de
l’indicateur du milieu. Les colonies caractéristiques sont isolées sur gélose nutritive puis
mises en cultures à 37°C pendant 24 heures.