Chapitre II :
Matériel et méthodes
35
IV.1. Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales (ISO 6887-3 :2017)
Dès l’arrivée des échantillons au laboratoire, chaque échantillon est réparti en cinq (5) unités
ce qui vaut 500g de poissons, soit 5 fois 100g.Puis, les poissons sont déposés sur un plateau
stérile devant un bec bunsen dans une hotte à flux laminaire.
A l’aide d’un ciseau et des pinces stériles , on réalise une incision pour produire une section
transversale, ensuite on enlève une section de la peau à l’aide d’une pince stérile et d’un
scalpel, on prélève et pèse 25 grammes de chair en forme de cube du muscle dorsal dans un
récipient stérile, le découpant en dés et l’introduire dans le sac à STOMACHERN en ajoutant
une quantité de 225ml ± 0,02 ml de diluant d’eau peptone tamponné jusqu’à obtenir une
masse totale de 250 grammes broyé et homogénéisé pendant 30 secondes.
La solution obtenue appelée solution mère qui est une suspension au 1 dans 10, laissée au
repos pendant quelques minutes pour assurer la revivification de germes stressés par
l’homogénéisation.
Des dilutions décimales de 10
-2 , 10
-3 ,10
-4 et 10
-5 ont été préparées dans des tubes à essai
contenant 9 ml ± 0,2 ml d’eau peptone tamponnée.
IV.2. Recherche et dénombrement de la flore aérobie totale à 30°C (ISO 4833-1 :2013)
Au moyen d’une pipette stérile on prélève 1 ml d’échantillon de la suspension mère (10
-1 ) et
des dilutions (10
-2 ,10
-3 ,10
-4 ,10
-5
) qu’on introduit aseptiquement dans les boîtes de Pétri à
usage unique .Verser dans chaque boîte de Petri environ 12 ml à 15 ml de gélose PCA (Plate
Count Agar) fondu et refroidi au bain marie à 45°C. Le mélange est homogénéisé par des
mouvements circulaires des boites, laisser le mélange se solidifier.
Après solidification complète 5 ml de PCA est ajouté. Cette deuxième couche permet
d’éviter l’envahissement de la boîte par les germes pouvant rendre difficile la lecture. Les
boîtes sont ensuite incubées à (30 ± 1) °C dans l’étuve. Le comptage se fait après 72 ± 2
heures d’incubation. Les colonies caractéristiques apparaissent blanchâtres de forme
lenticulaire.
Après la période d’incubation spécifiée, choisir les boîtes gélosées comportant, si possible,
moins de 300 colonies, on procède au comptage des colonies caractéristiques pour chaque
boite.
Matériel et méthodes
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IV.1. Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales (ISO 6887-3 :2017)
Dès l’arrivée des échantillons au laboratoire, chaque échantillon est réparti en cinq (5) unités
ce qui vaut 500g de poissons, soit 5 fois 100g.Puis, les poissons sont déposés sur un plateau
stérile devant un bec bunsen dans une hotte à flux laminaire.
A l’aide d’un ciseau et des pinces stériles , on réalise une incision pour produire une section
transversale, ensuite on enlève une section de la peau à l’aide d’une pince stérile et d’un
scalpel, on prélève et pèse 25 grammes de chair en forme de cube du muscle dorsal dans un
récipient stérile, le découpant en dés et l’introduire dans le sac à STOMACHERN en ajoutant
une quantité de 225ml ± 0,02 ml de diluant d’eau peptone tamponné jusqu’à obtenir une
masse totale de 250 grammes broyé et homogénéisé pendant 30 secondes.
La solution obtenue appelée solution mère qui est une suspension au 1 dans 10, laissée au
repos pendant quelques minutes pour assurer la revivification de germes stressés par
l’homogénéisation.
Des dilutions décimales de 10
-2 , 10
-3 ,10
-4 et 10
-5 ont été préparées dans des tubes à essai
contenant 9 ml ± 0,2 ml d’eau peptone tamponnée.
IV.2. Recherche et dénombrement de la flore aérobie totale à 30°C (ISO 4833-1 :2013)
Au moyen d’une pipette stérile on prélève 1 ml d’échantillon de la suspension mère (10
-1 ) et
des dilutions (10
-2 ,10
-3 ,10
-4 ,10
-5
) qu’on introduit aseptiquement dans les boîtes de Pétri à
usage unique .Verser dans chaque boîte de Petri environ 12 ml à 15 ml de gélose PCA (Plate
Count Agar) fondu et refroidi au bain marie à 45°C. Le mélange est homogénéisé par des
mouvements circulaires des boites, laisser le mélange se solidifier.
Après solidification complète 5 ml de PCA est ajouté. Cette deuxième couche permet
d’éviter l’envahissement de la boîte par les germes pouvant rendre difficile la lecture. Les
boîtes sont ensuite incubées à (30 ± 1) °C dans l’étuve. Le comptage se fait après 72 ± 2
heures d’incubation. Les colonies caractéristiques apparaissent blanchâtres de forme
lenticulaire.
Après la période d’incubation spécifiée, choisir les boîtes gélosées comportant, si possible,
moins de 300 colonies, on procède au comptage des colonies caractéristiques pour chaque
boite.