MATERIEL ET METHODES
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Les extraits de lipides sont conservés dissouts dans une concentration déterminée d’un
mélange de chloroforme : méthanol (2 :1, v/v) contenant 0,01 % (p/v) de BHT (Butyl
Hydroxy Toluèn). Afin de minimiser l’oxydation des extraits lipidiques durant la
conservation, l’air présent dans les petits flacons est chassé à l’aide de l’azote sec.
L’analyse des acides gras est effectuée par chromatographie en phase gazeuse à partir
des esters méthyliques des acides gras, obtenus par transméthylation des échantillons
lipidiques.
Transméthylation, purification et chromatographie
Selon le processus décrit par Christie en 1982, une quantité déterminée d’un extrait
lipidique est ajoutée à 1ml de toluène et 2ml d’une solution d’acide sulfurique H 2 SO 4 à 1% en
méthanol, et la soumettre à une température de 50ºC pour une durée de 16h. L’extraction des
esters méthyliques des acides se fait en deux fois successives ou la première est réalisée en
ajoutant 5ml d’eau distillée et 5ml d’une solution de l’héxane : éther di éthylique (1 :1, v/v).
Le surnageant est récupéré après une agitation et une centrifugation du mélange pendant 2
min à 600 g. La seconde extraction est réalisée en ajoutant 1.5 ml d’une solution de
bicarbonate de potassium KHCO 3 à 2% (p/v), et le surnageant est récupéré dans un autre tube
séché à sec après une agitation et centrifugation durant 2 min à 600g. A la fin l’extrait est
transféré dans un flacon en verre dans un volume de 140 µl d’hexane-éthers di éthylique.
La purification est faite par chromatographie en couche fine de plaques de gel de silice
G 60 imbibé d’un solvant composé de l’hexane : éther di éthylique : acide acétique glacial (85
:15 :1,5, v/v/v). La fraction de chaque échantillon est récupérée par grattage du gel de silice
correspondant à l’aire ou se trouve la fraction des esters méthyliques.
Les esters méthyliques des acides gras présents dans le gel de silice sont arrosés
d’hexane : éther di éthylique, après agitation et centrifugation durant 2 min à 600g la fraction
liquide est transférée dans un autre tube qui sera séché complètement à l’azote sec. Dans le
gel de silice. Les esters méthyliques sont récupérés dans des petits flacons de verre avec une
solution d’hexane contenant du BHT (0.01% p/v). Sous un gradient thermique de 50 à 220ºC,
les échantillons injectés en colonne subissent une élution avec l’hélium.
Dans le système informatique équipé de l’application Chrom-Card for Windows (CE
Instruments, Milan, Italie), les données du détecteur de la flamme pendant les 40 min de
l’élution des échantillons sont récupérées.
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Les extraits de lipides sont conservés dissouts dans une concentration déterminée d’un
mélange de chloroforme : méthanol (2 :1, v/v) contenant 0,01 % (p/v) de BHT (Butyl
Hydroxy Toluèn). Afin de minimiser l’oxydation des extraits lipidiques durant la
conservation, l’air présent dans les petits flacons est chassé à l’aide de l’azote sec.
L’analyse des acides gras est effectuée par chromatographie en phase gazeuse à partir
des esters méthyliques des acides gras, obtenus par transméthylation des échantillons
lipidiques.
Transméthylation, purification et chromatographie
Selon le processus décrit par Christie en 1982, une quantité déterminée d’un extrait
lipidique est ajoutée à 1ml de toluène et 2ml d’une solution d’acide sulfurique H 2 SO 4 à 1% en
méthanol, et la soumettre à une température de 50ºC pour une durée de 16h. L’extraction des
esters méthyliques des acides se fait en deux fois successives ou la première est réalisée en
ajoutant 5ml d’eau distillée et 5ml d’une solution de l’héxane : éther di éthylique (1 :1, v/v).
Le surnageant est récupéré après une agitation et une centrifugation du mélange pendant 2
min à 600 g. La seconde extraction est réalisée en ajoutant 1.5 ml d’une solution de
bicarbonate de potassium KHCO 3 à 2% (p/v), et le surnageant est récupéré dans un autre tube
séché à sec après une agitation et centrifugation durant 2 min à 600g. A la fin l’extrait est
transféré dans un flacon en verre dans un volume de 140 µl d’hexane-éthers di éthylique.
La purification est faite par chromatographie en couche fine de plaques de gel de silice
G 60 imbibé d’un solvant composé de l’hexane : éther di éthylique : acide acétique glacial (85
:15 :1,5, v/v/v). La fraction de chaque échantillon est récupérée par grattage du gel de silice
correspondant à l’aire ou se trouve la fraction des esters méthyliques.
Les esters méthyliques des acides gras présents dans le gel de silice sont arrosés
d’hexane : éther di éthylique, après agitation et centrifugation durant 2 min à 600g la fraction
liquide est transférée dans un autre tube qui sera séché complètement à l’azote sec. Dans le
gel de silice. Les esters méthyliques sont récupérés dans des petits flacons de verre avec une
solution d’hexane contenant du BHT (0.01% p/v). Sous un gradient thermique de 50 à 220ºC,
les échantillons injectés en colonne subissent une élution avec l’hélium.
Dans le système informatique équipé de l’application Chrom-Card for Windows (CE
Instruments, Milan, Italie), les données du détecteur de la flamme pendant les 40 min de
l’élution des échantillons sont récupérées.