Chapitre 2
Matériel et méthodes
21
II.2.5.2. Enrichissement
Après 24h d’incubation, 1 ml de bouillon de pré-enrichissement est transférée dans un tube
contenant 10 ml de milieu SFB + 1 disque SFB, et incuber à 37°C pendant 24h.
II.2.5.3. Isolement et lecture
Les cultures de SFB sont repiquées sur la gélose S-S en stries. L’incubation se fait à 37°C
pendant 24h.
Les colonies apparaissent transparentes avec ou sans centre noir (coloration noir due à la
production de H2S). Une identification biochimique est entamée, par la suite, avec une
coloration de Gram (bacille Gram négatif), application d’un test d’oxydase (oxydase positif)
et enfin une identification bactérienne sur galerie Api 20E.
II.2.6. Identification bactérienne
II.2.6.1. Coloration de Gram
Elle est réalisée suivant ces étapes :
Sur une lame propre, on pose une goutte d’eau distillée et on prélève une portion d’une
colonie bactérienne isolée et l’étaler sur la lame.
Sécher en approchant la lame de 15-20 cm au-dessus de la flamme du bec bunsen.
Réaliser une fixation, en tenant la lame avec une pince et la passer trois fois à la flamme.
On dépose quelques gouttes de violet de gentiane sur le frottis fixé et laisser agir 1 min
(Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries).
Jeter l’excès de colorant et rincer brièvement avec l’eau distillée.
Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis (le lugol permet de fixer le violet de
gentiane) et laisser agir 1 min.
Jeter l’excès et rincer brièvement avec l’eau distillée.
Égoutter et plonger la lame dans l’alcool pendant 15 secondes puis rincer doucement avec
l’eau distillée.
Décolorer en faisant couler la fuchsine sur la lame durant 1 min.
Laver à l’eau distillée et sécher la lame au-dessus de la flamme.
Matériel et méthodes
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II.2.5.2. Enrichissement
Après 24h d’incubation, 1 ml de bouillon de pré-enrichissement est transférée dans un tube
contenant 10 ml de milieu SFB + 1 disque SFB, et incuber à 37°C pendant 24h.
II.2.5.3. Isolement et lecture
Les cultures de SFB sont repiquées sur la gélose S-S en stries. L’incubation se fait à 37°C
pendant 24h.
Les colonies apparaissent transparentes avec ou sans centre noir (coloration noir due à la
production de H2S). Une identification biochimique est entamée, par la suite, avec une
coloration de Gram (bacille Gram négatif), application d’un test d’oxydase (oxydase positif)
et enfin une identification bactérienne sur galerie Api 20E.
II.2.6. Identification bactérienne
II.2.6.1. Coloration de Gram
Elle est réalisée suivant ces étapes :
Sur une lame propre, on pose une goutte d’eau distillée et on prélève une portion d’une
colonie bactérienne isolée et l’étaler sur la lame.
Sécher en approchant la lame de 15-20 cm au-dessus de la flamme du bec bunsen.
Réaliser une fixation, en tenant la lame avec une pince et la passer trois fois à la flamme.
On dépose quelques gouttes de violet de gentiane sur le frottis fixé et laisser agir 1 min
(Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries).
Jeter l’excès de colorant et rincer brièvement avec l’eau distillée.
Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis (le lugol permet de fixer le violet de
gentiane) et laisser agir 1 min.
Jeter l’excès et rincer brièvement avec l’eau distillée.
Égoutter et plonger la lame dans l’alcool pendant 15 secondes puis rincer doucement avec
l’eau distillée.
Décolorer en faisant couler la fuchsine sur la lame durant 1 min.
Laver à l’eau distillée et sécher la lame au-dessus de la flamme.