Antigène + Anticorps + Antigène125
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Complexe antigène-Anticorps
Complexe antigène ^l-Anticorps
Séparation
(forme libre-liée)
Mesure de la radioactivité liée dans un compteur y
Figure 9.11 • Principe du dosage par compétition.
Comme pour la radioimmunologie en phase hétérogène, une étape de séparation
de l'Ag lié à l'Ac de l'Ag libre est obligatoire. La méthode sandwich, utilisable si
l'Ag à doser possède au moins deux sites antigéniques est souvent employée.
Les Ac en excès sont fixés sur une phase solide (comme la paroi du tube réactionnel) et ils fixent tous les Ag à doser dans l'échantillon. Après lavage on
incube en présence d'un deuxième Ac marqué par une enzyme (conjugué)
qui se fixe sur le deuxième site antigénique. Un deuxième lavage élimine le
conjugué non lié et l'on ajoute le substrat pour développer la réaction enzymatique, elle-même observée par une réaction colorée facile à mesurer.
Les enzymes les plus utilisées sont :
- La peroxydase du raifort. Son substrat est l'ortho-phénylène diamine ou la
triméthyl benzidine, en présence d'eau oxygénée.
- La galactosidase d'E. coll.
- La phosphatase alcaline d'intestin de veau ou d'E. coli.
Le principe réactionnel est représenté sur la figure 9.12.
4.2.1.3. Marquage par fluorescence
Les techniques d'immunofluorescence (FIA ou « fluorescence immunoassay »)
sont basées sur la mesure de la fluorescence émise par le marqueur et permettent
d'atteindre des seuils de détection voisins de ceux de la radioimmunologie.