472 trOiSiÈMe partie La génétique
s’en servir pour distinguer un hétérozygote (dans ce cas,
pour l’allèle de cellules falciformes) d’un individu homozygote pour l’allèle normal.
L’identification de porteurs d’allèles mutants associés à
des maladies génétiques n’est qu’une des applications du
buvardage de Southern. En fait, pendant de nombreuses
années, cette technique a constitué un élément fondamental
des analyses de laboratoire. Récemment, toutefois, elle a été
supplantée par des méthodes plus rapides faisant souvent
appel à l’ACP que l’on effectue sur des parties spécifiques de
génomes susceptibles de présenter des différences.
Le séquençage de l’aDN
Une fois qu’un gène est cloné, on peut en déterminer la
séquence nucléotidique complète. Aujourd’hui, le séquençage
est automatisé, effectué par des appareils spécialisés (voir la
figure 1.12, p. 10). La première méthode automatisée était basée
sur une technique appelée méthode de terminaison de chaîne par
un didésoxyribonucléotide (méthode didésoxy, en abrégé), pour des
raisons décrites à la figure figure 20.12. Cette technique a été
mise au point par le Britannique Frederick Sanger, qui a reçu
un prix Nobel en 1980 pour cette réalisation. (Sanger est l’une
des quatre personnes à avoir reçu deux prix Nobel ; il en avait
également reçu un en 1975 pour la détermination de la
séquence des acides aminés dans l’insuline.)
Au cours des dix dernières années, on a mis au point plusieurs techniques de séquençage dites « de la prochaine génération » qui ne reposent pas sur la méthode de terminaison de
chaîne. Une autre solution consiste à immobiliser un seul
brin matrice et à ajouter des réactifs qui permettent ce qu’on
appelle communément le séquençage par synthèse d’un brin
complémentaire, un nucléotide à la fois. Une astuce chimique
rend des moniteurs électroniques capables de préciser lequel
des quatre nucléotides est ajouté, permettant ainsi de déterminer la séquence. D’autres changements techniques ont
donné naissance au « séquençage de troisième génération »,
chaque nouvelle technique s’avérant plus rapide et moins
coûteuse que la précédente. Au chapitre 21, vous en apprendrez davantage sur les progrès de l’étude des gènes et des
génomes entiers apportés par cette accélération rapide de la
technologie du séquençage.
Connaître la séquence d’un gène permet aux chercheurs
de le comparer directement aux gènes d’autres espèces, chez
qui la fonction du produit du gène peut être connue. Si
deux gènes d’espèces différentes ont des séquences assez
similaires, il est raisonnable de supposer que leurs produits
de gènes remplissent des fonctions similaires. De cette
façon, les comparaisons entre les séquences fournissent des
indices sur la fonction d’un gène, un sujet sur lequel nous
reviendrons bientôt. Une autre série d’indices est fournie
par des approches expérimentales qui analysent quand et
où un gène est exprimé.
L’analyse de l’expression génique
Après avoir cloné un gène donné, les chercheurs peuvent
fabriquer des sondes d’acides nucléiques marquées capables
de s’hybrider avec les ARNm transcrits du gène. Ces sondes
permettent d’obtenir des informations sur le site et le moment
où le gène sera transcrit dans l’organisme. Les niveaux de
transcription sont communément utilisés comme mesure de
l’expression génétique.
L’étude de l’expression de gènes uniques
Supposons qu’on veuille trouver comment l’expression du gène
de la bglobine change au cours du développement embryonnaire du colibri. Il existe au moins deux façons d’y arriver.
La première méthode est appelée buvardage de Northern
(un jeu de mots basé sur la proche similitude avec le buvardage mis au point par Edwin Southern). Dans cette méthode,
on effectue une électrophorèse sur gel des échantillons
d’ARNm d’embryons de colibris à différentes étapes du développement ; on transfère alors les échantillons sur une membrane de nitrocellulose, puis on laisse les ARNm sur la
membrane afin qu’ils s’hybrident avec une sonde marquée
qui reconnaît l’ARNm de la bglobine. Si on expose une pellicule photographique au contact de la membrane, l’image
résultante ressemblera à celle du buvardage de Southern de la
figure 20.11, avec une bande d’une taille donnée apparaissant dans chaque échantillon. Si la bande d’ARNm est observée à une étape particulière, on peut avancer l’hypothèse que
la protéine fonctionne au cours d’événements qui ont lieu à
cette étape. À l’instar du buvardage de Southern, le buvardage de Northern a constitué une technique incontournable
au cours des ans, mais, dans de nombreux laboratoires, il est
maintenant remplacé par d’autres procédés.
La technique appelée transcription inverse suivie
d’une amplification en chaîne par polymérase ou
RTPCR (pour reverse transcriptasepolymerase chain reaction)
(figure 20.13, page 474) est une méthode plus rapide et plus
sensible que le buvardage de Northern (parce qu’elle requiert
moins d’ARNm), ce qui explique son utilisation sans cesse
croissante. L’analyse de l’expression du gène de la bglobine
du colibri par la technique de RTPCR commence de façon
semblable au buvardage de Northern, c’estàdire par l’isolation des ARNm à différents stades de développement des
embryons de colibris. On ajoute ensuite de la transcriptase
inverse pour produire de l’ADNc qui sert alors de matrice pour
l’amplification en chaîne par polymérase en utilisant des
amorces du gène de la bglobine. Lorsque les produits sont
déposés sur un gel, on observe des copies de la région amplifiée sous forme de bandes seulement dans les échantillons qui
contenaient à l’origine l’ARNm de la bglobine. Dans le cas de
la bglobine du colibri, par exemple, on pourrait s’attendre
à voir une bande apparaître au stade où les globules rouges
commencent à se former, et tous les stades de développement
subséquents révéleraient la même bande. Il est également possible de réaliser une RTPCR à partir d’ARNm prélevés de différents tissus à un moment donné pour découvrir lequel produit
un ARNm spécifique.
Une autre méthode pour déterminer quels tissus ou quelles
cellules expriment certains gènes consiste à repérer le site d’un
ARNm spécifique à l’aide de sondes marquées in situ, ou sur
place, dans l’organisme intact. Cette technique, appelée
hybridation in situ, est le plus souvent effectuée avec des
sondes marquées par des molécules fluorescentes (voir le chapitre 6). Différentes sondes peuvent être marquées à l’aide de
différents colorants, parfois présentant des résultats d’une
beauté frappante (figure 20.14, page 474).
s’en servir pour distinguer un hétérozygote (dans ce cas,
pour l’allèle de cellules falciformes) d’un individu homozygote pour l’allèle normal.
L’identification de porteurs d’allèles mutants associés à
des maladies génétiques n’est qu’une des applications du
buvardage de Southern. En fait, pendant de nombreuses
années, cette technique a constitué un élément fondamental
des analyses de laboratoire. Récemment, toutefois, elle a été
supplantée par des méthodes plus rapides faisant souvent
appel à l’ACP que l’on effectue sur des parties spécifiques de
génomes susceptibles de présenter des différences.
Le séquençage de l’aDN
Une fois qu’un gène est cloné, on peut en déterminer la
séquence nucléotidique complète. Aujourd’hui, le séquençage
est automatisé, effectué par des appareils spécialisés (voir la
figure 1.12, p. 10). La première méthode automatisée était basée
sur une technique appelée méthode de terminaison de chaîne par
un didésoxyribonucléotide (méthode didésoxy, en abrégé), pour des
raisons décrites à la figure figure 20.12. Cette technique a été
mise au point par le Britannique Frederick Sanger, qui a reçu
un prix Nobel en 1980 pour cette réalisation. (Sanger est l’une
des quatre personnes à avoir reçu deux prix Nobel ; il en avait
également reçu un en 1975 pour la détermination de la
séquence des acides aminés dans l’insuline.)
Au cours des dix dernières années, on a mis au point plusieurs techniques de séquençage dites « de la prochaine génération » qui ne reposent pas sur la méthode de terminaison de
chaîne. Une autre solution consiste à immobiliser un seul
brin matrice et à ajouter des réactifs qui permettent ce qu’on
appelle communément le séquençage par synthèse d’un brin
complémentaire, un nucléotide à la fois. Une astuce chimique
rend des moniteurs électroniques capables de préciser lequel
des quatre nucléotides est ajouté, permettant ainsi de déterminer la séquence. D’autres changements techniques ont
donné naissance au « séquençage de troisième génération »,
chaque nouvelle technique s’avérant plus rapide et moins
coûteuse que la précédente. Au chapitre 21, vous en apprendrez davantage sur les progrès de l’étude des gènes et des
génomes entiers apportés par cette accélération rapide de la
technologie du séquençage.
Connaître la séquence d’un gène permet aux chercheurs
de le comparer directement aux gènes d’autres espèces, chez
qui la fonction du produit du gène peut être connue. Si
deux gènes d’espèces différentes ont des séquences assez
similaires, il est raisonnable de supposer que leurs produits
de gènes remplissent des fonctions similaires. De cette
façon, les comparaisons entre les séquences fournissent des
indices sur la fonction d’un gène, un sujet sur lequel nous
reviendrons bientôt. Une autre série d’indices est fournie
par des approches expérimentales qui analysent quand et
où un gène est exprimé.
L’analyse de l’expression génique
Après avoir cloné un gène donné, les chercheurs peuvent
fabriquer des sondes d’acides nucléiques marquées capables
de s’hybrider avec les ARNm transcrits du gène. Ces sondes
permettent d’obtenir des informations sur le site et le moment
où le gène sera transcrit dans l’organisme. Les niveaux de
transcription sont communément utilisés comme mesure de
l’expression génétique.
L’étude de l’expression de gènes uniques
Supposons qu’on veuille trouver comment l’expression du gène
de la bglobine change au cours du développement embryonnaire du colibri. Il existe au moins deux façons d’y arriver.
La première méthode est appelée buvardage de Northern
(un jeu de mots basé sur la proche similitude avec le buvardage mis au point par Edwin Southern). Dans cette méthode,
on effectue une électrophorèse sur gel des échantillons
d’ARNm d’embryons de colibris à différentes étapes du développement ; on transfère alors les échantillons sur une membrane de nitrocellulose, puis on laisse les ARNm sur la
membrane afin qu’ils s’hybrident avec une sonde marquée
qui reconnaît l’ARNm de la bglobine. Si on expose une pellicule photographique au contact de la membrane, l’image
résultante ressemblera à celle du buvardage de Southern de la
figure 20.11, avec une bande d’une taille donnée apparaissant dans chaque échantillon. Si la bande d’ARNm est observée à une étape particulière, on peut avancer l’hypothèse que
la protéine fonctionne au cours d’événements qui ont lieu à
cette étape. À l’instar du buvardage de Southern, le buvardage de Northern a constitué une technique incontournable
au cours des ans, mais, dans de nombreux laboratoires, il est
maintenant remplacé par d’autres procédés.
La technique appelée transcription inverse suivie
d’une amplification en chaîne par polymérase ou
RTPCR (pour reverse transcriptasepolymerase chain reaction)
(figure 20.13, page 474) est une méthode plus rapide et plus
sensible que le buvardage de Northern (parce qu’elle requiert
moins d’ARNm), ce qui explique son utilisation sans cesse
croissante. L’analyse de l’expression du gène de la bglobine
du colibri par la technique de RTPCR commence de façon
semblable au buvardage de Northern, c’estàdire par l’isolation des ARNm à différents stades de développement des
embryons de colibris. On ajoute ensuite de la transcriptase
inverse pour produire de l’ADNc qui sert alors de matrice pour
l’amplification en chaîne par polymérase en utilisant des
amorces du gène de la bglobine. Lorsque les produits sont
déposés sur un gel, on observe des copies de la région amplifiée sous forme de bandes seulement dans les échantillons qui
contenaient à l’origine l’ARNm de la bglobine. Dans le cas de
la bglobine du colibri, par exemple, on pourrait s’attendre
à voir une bande apparaître au stade où les globules rouges
commencent à se former, et tous les stades de développement
subséquents révéleraient la même bande. Il est également possible de réaliser une RTPCR à partir d’ARNm prélevés de différents tissus à un moment donné pour découvrir lequel produit
un ARNm spécifique.
Une autre méthode pour déterminer quels tissus ou quelles
cellules expriment certains gènes consiste à repérer le site d’un
ARNm spécifique à l’aide de sondes marquées in situ, ou sur
place, dans l’organisme intact. Cette technique, appelée
hybridation in situ, est le plus souvent effectuée avec des
sondes marquées par des molécules fluorescentes (voir le chapitre 6). Différentes sondes peuvent être marquées à l’aide de
différents colorants, parfois présentant des résultats d’une
beauté frappante (figure 20.14, page 474).