chapitre 20 La biotechnologie
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de l’ADN génomique digéré par une enzyme de restriction
et révélé à l’aide d’un colorant produit trop de bandes pour
qu’on soit capable de les reconnaître individuellement.
Cependant, on peut détecter seulement les bandes qui contiennent des parties du gène de la bglobine en recourant à
une méthode classique appelée buvardage de Southern,
qui combine l’électrophorèse sur gel et l’hybridation moléculaire. (Cette méthode est aussi appelée transfert de Southern ;
elle a été mise au point en 1975 par le biochimiste britannique Edwin Southern.) Le principe est identique à celui de
l’hybridation moléculaire utilisée pour sélectionner les
clones bactériens (voir la figure 20.7). Dans le buvardage de
Southern, la sonde est généralement une molécule d’ADN
monocaténaire radioactive (ou marquée autrement) qui est
complémentaire au gène recherché. La figure 20.11 résume
l’ensemble de la technique et montre comment on peut
. Figure 20.11
L’analyse de fragments d’aDN par la technique du buvardage de Southern
applICatIon Cette méthode permet aux chercheurs de détecter des
séquences nucléotidiques particulières dans un échantillon complexe
d’ADN. Le buvardage de Southern peut servir notamment à comparer les
fragments de restriction produits à partir de différents échantillons
d’ADN génomique.
teCHnIQue Dans cet exemple, nous comparons des échantillons d’ADN
génomique provenant de trois individus : un homozygote pour l’allèle normal
de la b-globine (I), un homozygote pour l’allèle mutant des cellules falciformes (II) et un hétérozygote (III). Comme à la figure 20.7, nous prenons
l’exemple d’une sonde radioactive, mais on peut faire appel à d’autres
méthodes de marquage et de détection.
ADN + enzyme de restriction
I Allèle
normal de
la -globine
II Allèle
des cellules
falciformes
III Hétérozygote
Fragments
de restriction
I
II III
I
II
III
Membrane
de nitrocellulose
(buvard)
Solution
alcaline
Solution dans un sac de plastique
contenant la sonde marquée
d’un isotope radioactif
pour le gène de la -globine.
La sonde se lie par des liaisons hydrogène
à des fragments contenant des séquences
d’ADN de la -globine normale ou mutante.
Buvard de nitrocellulose
Serviettes
en papier
Gel
Préparation des fragments de restriction.
Chaque échantillon d’ADN est mélangé à
la même enzyme de restriction (dans ce cas,
DdeI. La digestion de chaque échantillon donne
un mélange de milliers de fragments de restriction.
1
Hybridation à l’aide d’une sonde marquée. La membrane de nitrocellulose est mise
en présence d’une solution contenant une sonde marquée d’une façon quelconque.
Dans cet exemple, la sonde est marquée d’un isotope radioactif, un ADN monocaténaire
complémentaire au gène de la -globine. Les molécules de la sonde se lient par appariement
des bases avec les fragments de restriction contenant une partie du gène de la -globine.
(Les bandes ne seraient pas visibles encore.)
4
Détection de la sonde. Une pellicule
photographique est placée sur le buvard.
La radioactivité de la sonde liée mène
à la reproduction, sur la pellicule, de l’image
des bandes contenant l’ADN dont les bases
sont appariées avec la sonde.
5
Électrophorèse sur gel. Les fragments de
restriction formés à partir de chaque échantillon
sont séparés par électrophorèse. Chaque
échantillon a un motif de bandes caractéristique.
(En réalité, les bandes devraient être beaucoup
plus nombreuses que celles qui sont illustrées,
et elles seraient invisibles, à moins d’être colorées.)
2
3 Transfert d’ADN (buvardage). Le gel étant
disposé comme on le voit ci-dessus, une solution
alcaline monte et passe à travers le gel sous
l’effet de la capillarité ; l’ADN se trouve ainsi
dénaturé et transféré sur une membrane
de nitrocellulose. Cela produit un buvard avec
un motif de bandes d’ADN identiques à celles
qui sont présentes dans le gel.
Éponge
Pellicule
photographique
sur le buvard
I
II
III
Fragment de l’allèle
de la -globine
à cellules falciformes
Fragment de l’allèle
de la -globine normale
Poids
lourd
résultats Les motifs de bandes pour les trois échantillons sont tout à
fait différents, de sorte qu’on peut utiliser cette méthode pour isoler les
porteurs hétérozygotes de l’allèle des cellules falciformes (III), de même
que ceux qui souffrent de la maladie, qui ont deux allèles mutants (II), et
les individus qui ne sont pas touchés, qui possèdent deux allèles normaux
(I). Les motifs de bandes pour les échantillons I et II ressemblent à ceux
des allèles normal et mutant purifiés, respectivement, qu’on voit à la
figure 20.10b. Le motif de bandes pour l’échantillon provenant de l’hétérozygote (III) est une combinaison des motifs pour les deux homozygotes
(I et II).
MéthODe De recher che
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de l’ADN génomique digéré par une enzyme de restriction
et révélé à l’aide d’un colorant produit trop de bandes pour
qu’on soit capable de les reconnaître individuellement.
Cependant, on peut détecter seulement les bandes qui contiennent des parties du gène de la bglobine en recourant à
une méthode classique appelée buvardage de Southern,
qui combine l’électrophorèse sur gel et l’hybridation moléculaire. (Cette méthode est aussi appelée transfert de Southern ;
elle a été mise au point en 1975 par le biochimiste britannique Edwin Southern.) Le principe est identique à celui de
l’hybridation moléculaire utilisée pour sélectionner les
clones bactériens (voir la figure 20.7). Dans le buvardage de
Southern, la sonde est généralement une molécule d’ADN
monocaténaire radioactive (ou marquée autrement) qui est
complémentaire au gène recherché. La figure 20.11 résume
l’ensemble de la technique et montre comment on peut
. Figure 20.11
L’analyse de fragments d’aDN par la technique du buvardage de Southern
applICatIon Cette méthode permet aux chercheurs de détecter des
séquences nucléotidiques particulières dans un échantillon complexe
d’ADN. Le buvardage de Southern peut servir notamment à comparer les
fragments de restriction produits à partir de différents échantillons
d’ADN génomique.
teCHnIQue Dans cet exemple, nous comparons des échantillons d’ADN
génomique provenant de trois individus : un homozygote pour l’allèle normal
de la b-globine (I), un homozygote pour l’allèle mutant des cellules falciformes (II) et un hétérozygote (III). Comme à la figure 20.7, nous prenons
l’exemple d’une sonde radioactive, mais on peut faire appel à d’autres
méthodes de marquage et de détection.
ADN + enzyme de restriction
I Allèle
normal de
la -globine
II Allèle
des cellules
falciformes
III Hétérozygote
Fragments
de restriction
I
II III
I
II
III
Membrane
de nitrocellulose
(buvard)
Solution
alcaline
Solution dans un sac de plastique
contenant la sonde marquée
d’un isotope radioactif
pour le gène de la -globine.
La sonde se lie par des liaisons hydrogène
à des fragments contenant des séquences
d’ADN de la -globine normale ou mutante.
Buvard de nitrocellulose
Serviettes
en papier
Gel
Préparation des fragments de restriction.
Chaque échantillon d’ADN est mélangé à
la même enzyme de restriction (dans ce cas,
DdeI. La digestion de chaque échantillon donne
un mélange de milliers de fragments de restriction.
1
Hybridation à l’aide d’une sonde marquée. La membrane de nitrocellulose est mise
en présence d’une solution contenant une sonde marquée d’une façon quelconque.
Dans cet exemple, la sonde est marquée d’un isotope radioactif, un ADN monocaténaire
complémentaire au gène de la -globine. Les molécules de la sonde se lient par appariement
des bases avec les fragments de restriction contenant une partie du gène de la -globine.
(Les bandes ne seraient pas visibles encore.)
4
Détection de la sonde. Une pellicule
photographique est placée sur le buvard.
La radioactivité de la sonde liée mène
à la reproduction, sur la pellicule, de l’image
des bandes contenant l’ADN dont les bases
sont appariées avec la sonde.
5
Électrophorèse sur gel. Les fragments de
restriction formés à partir de chaque échantillon
sont séparés par électrophorèse. Chaque
échantillon a un motif de bandes caractéristique.
(En réalité, les bandes devraient être beaucoup
plus nombreuses que celles qui sont illustrées,
et elles seraient invisibles, à moins d’être colorées.)
2
3 Transfert d’ADN (buvardage). Le gel étant
disposé comme on le voit ci-dessus, une solution
alcaline monte et passe à travers le gel sous
l’effet de la capillarité ; l’ADN se trouve ainsi
dénaturé et transféré sur une membrane
de nitrocellulose. Cela produit un buvard avec
un motif de bandes d’ADN identiques à celles
qui sont présentes dans le gel.
Éponge
Pellicule
photographique
sur le buvard
I
II
III
Fragment de l’allèle
de la -globine
à cellules falciformes
Fragment de l’allèle
de la -globine normale
Poids
lourd
résultats Les motifs de bandes pour les trois échantillons sont tout à
fait différents, de sorte qu’on peut utiliser cette méthode pour isoler les
porteurs hétérozygotes de l’allèle des cellules falciformes (III), de même
que ceux qui souffrent de la maladie, qui ont deux allèles mutants (II), et
les individus qui ne sont pas touchés, qui possèdent deux allèles normaux
(I). Les motifs de bandes pour les échantillons I et II ressemblent à ceux
des allèles normal et mutant purifiés, respectivement, qu’on voit à la
figure 20.10b. Le motif de bandes pour l’échantillon provenant de l’hétérozygote (III) est une combinaison des motifs pour les deux homozygotes
(I et II).
MéthODe De recher che