470 trOiSiÈMe partie La génétique
les molécules d’acides nucléiques se déplacent toutes vers le
pôle positif quand elles sont soumises à un champ électrique.
Pendant le déplacement des molécules, le réseau de fibres
d’agarose du gel ralentit davantage les longs fragments que
les courts, de sorte que les molécules se répartissent selon
leur taille. Par conséquent, l’électrophorèse sur gel sépare un
mélange de molécules d’ADN linéaires en bandes successives,
chaque bande contenant plusieurs milliers de molécules
d’ADN de la même longueur.
Une application historiquement utile de cette technique a
été l’analyse des fragments de restriction, qui fournit rapidement
des informations sur les séquences d’ADN. Avec les progrès réalisés dans la technologie du séquençage, l’approche favorisée
dans les laboratoires modernes consiste souvent à séquencer
simplement l’échantillon d’ADN en question. Cependant,
l’analyse de fragments de restriction est encore effectuée dans
certains cas, et la compréhension de cette méthode permet de
mieux saisir en quoi consiste la technologie de l’ADN recombiné. Dans ce type d’analyse, on sépare les fragments résultant du découpage d’une molécule d’ADN à l’aide d’une
enzyme de restriction en soumettant le mélange à une électrophorèse sur gel. Ce mélange produit alors un motif de bandes
caractéristique de la molécule de départ et de l’enzyme de restriction employée. Il est même possible de reconnaître les
molécules d’ADN relativement petites provenant de plasmides
et de virus grâce aux motifs formés par leurs fragments de
restriction. Étant donné que l’ADN peut être extrait des gels
tout en restant intact, cette méthode permet de préparer des
échantillons purs de fragments individuels, en supposant
que les bandes sont clairement distinctes. (Les molécules d’ADN
plus longues, comme celles des chromosomes d’Eucaryotes,
produisent trop de fragments : les bandes sont diffuses et
donc plus difficiles à distinguer.)
L’analyse de fragments de restriction peut également servir
à comparer deux molécules distinctes d’ADN représentant, par
exemple, deux allèles d’un gène, à condition toutefois que la
différence des nucléotides influe sur un site de restriction. Une
modification dans une seule paire de bases de cette séquence
empêche une enzyme de restriction de couper à cet endroit.
Les variations dans la séquence d’ADN au sein d’une population sont appelées polymorphismes (du grec polus, « nombreux »,
et morphè, « forme »), et ce type particulier de modifications
de séquences est appelé polymorphisme de taille des fragments de restriction ou PTFR (en anglais RFLP, pour restriction fragment length polymorphism). Si un allèle contient un
PTFR, la digestion à l’aide de l’enzyme qui reconnaît le site
produira un mélange différent de fragments provenant de
chaque allèle. Et dans l’électrophorèse, chaque mélange produit son propre motif de bandes.
Par exemple, l’anémie à hématies falci formes résulte d’une
mutation dans un seul nucléotide situé dans une séquence
de restriction (un PTFR) du gène de la bglobine humaine
(voir les pages 316 et 317 et la figure 17.23, p. 398). Par conséquent, même si on a recours aujourd’hui à d’autres méthodes,
l’analyse de fragments de restriction a permis pendant de
nom breuses années de distinguer les allèles normaux et ceux
de l’anémie à hématies falciformes du gène de la bglobine,
comme l’illustre la figure 20.10.
Dans cette figure, les matériaux de départ sont des échantillons de gènes clonés et purifiés d’allèles de la bglobine.
Mais comment pourraiton effectuer ce test si l’on ne dispose
pas d’allèles purifiés au départ ? Afin de déterminer si un
individu est porteur hétérozygote de l’allèle mutant pour
l’anémie à hématies falciformes, il faudrait comparer directement son ADN génomique avec celui d’une personne souffrant d’anémie à hématies falciformes (et hétérozygote pour
l’allèle mutant) et celui d’un homozygote pour l’allèle normal. Comme nous l’avons déjà mentionné, l’électrophorèse
m Figure 20.10 La reconnaissance de l’ADN provenant d’allèles
normaux et d’allèles de cellules falciformes du gène de la b-globine
humaine au moyen de l’analyse des fragments de restriction.
(a) La mutation portée par les cellules falciformes détruit un des sites
de restriction de l’enzyme DdeI dans le gène. (b) Après cette étape,
la digestion par l’enzyme DdeI produit une variété de fragments provenant
des allèles normaux et des allèles de cellules falciformes.
et sI ?
En supposant que des clones bactériens avec des plasmides
recombinés contiennent chacun de ces allèles, comment pourriez-vous
isoler les échantillons d’ADN pur appliqués sur le gel en (b) ? (Indice :
étudiez les figures 20.4 et 20.9.)
Allèle mutant à cellules falciformes de la -globine
Allèle normal de la -globine
Allèle
normal
Allèle
des cellules falciformes
Fragment
long
376 bp
201 bp
175 bp
DdeI
DdeI
DdeI
DdeI
175 bp
201 bp
Fragment long
DdeI
DdeI
DdeI
376 bp
Fragment long
(a) Sites de restriction de DdeI dans les allèles normaux
et dans les allèles des cellules falciformes du gène de la
-globine. Nous représentons ici les allèles clonés, séparés de l’ADN
vecteur, mais incluant un peu d’ADN voisin de la séquence de codage.
L’allèle normal contient deux sites dans la séquence de codage
reconnus par l’enzyme de restriction DdeI. Il manque un de ces sites
à l’allèle des cellules falciformes.
(b) Électrophorèse des fragments de restriction d’allèles normaux
et d’allèles de cellules falciformes. Les échantillons de chaque
allèle purifié ont été découpés par l’enzyme DdeI puis soumis à
l’électrophorèse sur gel ; il en résulte trois bandes pour l’allèle normal
et deux bandes pour l’allèle des cellules falciformes. (Les minuscules
fragments aux extrémités des deux molécules d’ADN de départ sont
identiques et ne sont pas visibles ici.)
les molécules d’acides nucléiques se déplacent toutes vers le
pôle positif quand elles sont soumises à un champ électrique.
Pendant le déplacement des molécules, le réseau de fibres
d’agarose du gel ralentit davantage les longs fragments que
les courts, de sorte que les molécules se répartissent selon
leur taille. Par conséquent, l’électrophorèse sur gel sépare un
mélange de molécules d’ADN linéaires en bandes successives,
chaque bande contenant plusieurs milliers de molécules
d’ADN de la même longueur.
Une application historiquement utile de cette technique a
été l’analyse des fragments de restriction, qui fournit rapidement
des informations sur les séquences d’ADN. Avec les progrès réalisés dans la technologie du séquençage, l’approche favorisée
dans les laboratoires modernes consiste souvent à séquencer
simplement l’échantillon d’ADN en question. Cependant,
l’analyse de fragments de restriction est encore effectuée dans
certains cas, et la compréhension de cette méthode permet de
mieux saisir en quoi consiste la technologie de l’ADN recombiné. Dans ce type d’analyse, on sépare les fragments résultant du découpage d’une molécule d’ADN à l’aide d’une
enzyme de restriction en soumettant le mélange à une électrophorèse sur gel. Ce mélange produit alors un motif de bandes
caractéristique de la molécule de départ et de l’enzyme de restriction employée. Il est même possible de reconnaître les
molécules d’ADN relativement petites provenant de plasmides
et de virus grâce aux motifs formés par leurs fragments de
restriction. Étant donné que l’ADN peut être extrait des gels
tout en restant intact, cette méthode permet de préparer des
échantillons purs de fragments individuels, en supposant
que les bandes sont clairement distinctes. (Les molécules d’ADN
plus longues, comme celles des chromosomes d’Eucaryotes,
produisent trop de fragments : les bandes sont diffuses et
donc plus difficiles à distinguer.)
L’analyse de fragments de restriction peut également servir
à comparer deux molécules distinctes d’ADN représentant, par
exemple, deux allèles d’un gène, à condition toutefois que la
différence des nucléotides influe sur un site de restriction. Une
modification dans une seule paire de bases de cette séquence
empêche une enzyme de restriction de couper à cet endroit.
Les variations dans la séquence d’ADN au sein d’une population sont appelées polymorphismes (du grec polus, « nombreux »,
et morphè, « forme »), et ce type particulier de modifications
de séquences est appelé polymorphisme de taille des fragments de restriction ou PTFR (en anglais RFLP, pour restriction fragment length polymorphism). Si un allèle contient un
PTFR, la digestion à l’aide de l’enzyme qui reconnaît le site
produira un mélange différent de fragments provenant de
chaque allèle. Et dans l’électrophorèse, chaque mélange produit son propre motif de bandes.
Par exemple, l’anémie à hématies falci formes résulte d’une
mutation dans un seul nucléotide situé dans une séquence
de restriction (un PTFR) du gène de la bglobine humaine
(voir les pages 316 et 317 et la figure 17.23, p. 398). Par conséquent, même si on a recours aujourd’hui à d’autres méthodes,
l’analyse de fragments de restriction a permis pendant de
nom breuses années de distinguer les allèles normaux et ceux
de l’anémie à hématies falciformes du gène de la bglobine,
comme l’illustre la figure 20.10.
Dans cette figure, les matériaux de départ sont des échantillons de gènes clonés et purifiés d’allèles de la bglobine.
Mais comment pourraiton effectuer ce test si l’on ne dispose
pas d’allèles purifiés au départ ? Afin de déterminer si un
individu est porteur hétérozygote de l’allèle mutant pour
l’anémie à hématies falciformes, il faudrait comparer directement son ADN génomique avec celui d’une personne souffrant d’anémie à hématies falciformes (et hétérozygote pour
l’allèle mutant) et celui d’un homozygote pour l’allèle normal. Comme nous l’avons déjà mentionné, l’électrophorèse
m Figure 20.10 La reconnaissance de l’ADN provenant d’allèles
normaux et d’allèles de cellules falciformes du gène de la b-globine
humaine au moyen de l’analyse des fragments de restriction.
(a) La mutation portée par les cellules falciformes détruit un des sites
de restriction de l’enzyme DdeI dans le gène. (b) Après cette étape,
la digestion par l’enzyme DdeI produit une variété de fragments provenant
des allèles normaux et des allèles de cellules falciformes.
et sI ?
En supposant que des clones bactériens avec des plasmides
recombinés contiennent chacun de ces allèles, comment pourriez-vous
isoler les échantillons d’ADN pur appliqués sur le gel en (b) ? (Indice :
étudiez les figures 20.4 et 20.9.)
Allèle mutant à cellules falciformes de la -globine
Allèle normal de la -globine
Allèle
normal
Allèle
des cellules falciformes
Fragment
long
376 bp
201 bp
175 bp
DdeI
DdeI
DdeI
DdeI
175 bp
201 bp
Fragment long
DdeI
DdeI
DdeI
376 bp
Fragment long
(a) Sites de restriction de DdeI dans les allèles normaux
et dans les allèles des cellules falciformes du gène de la
-globine. Nous représentons ici les allèles clonés, séparés de l’ADN
vecteur, mais incluant un peu d’ADN voisin de la séquence de codage.
L’allèle normal contient deux sites dans la séquence de codage
reconnus par l’enzyme de restriction DdeI. Il manque un de ces sites
à l’allèle des cellules falciformes.
(b) Électrophorèse des fragments de restriction d’allèles normaux
et d’allèles de cellules falciformes. Les échantillons de chaque
allèle purifié ont été découpés par l’enzyme DdeI puis soumis à
l’électrophorèse sur gel ; il en résulte trois bandes pour l’allèle normal
et deux bandes pour l’allèle des cellules falciformes. (Les minuscules
fragments aux extrémités des deux molécules d’ADN de départ sont
identiques et ne sont pas visibles ici.)