chapitre 20 La biotechnologie
473
.  Figure 20.12
Le séquençage de l’aDN par la méthode de terminaison de chaîne par un didésoxyribonucléotide
applICatIon  Grâce à des appareils spécialisés qui effectuent les réactions de séquençage et séparent les produits
marqués selon la longueur, on peut déterminer rapidement la séquence des nucléotides dans un fragment d’ADN cloné
pouvant comporter entre 800 et 1 000 paires de bases.
teCHnIQue  Cette méthode consiste à synthétiser un ensemble de brins d’ADN complémentaires au fragment d’ADN
original. Chaque brin débute par la même amorce et se termine avec un didésoxyribonucléotide (ddNTP), c’est-à-dire un
nucléotide modifié. L’incorporation d’un ddNTP met fin à un brin d’ADN en croissance, parce qu’il lui manque le groupement 3’ —OH qui rendrait possible l’insertion du nucléotide suivant (voir la figure 16.14, p. 364). Dans l’ensemble de brins
synthétisés, la position de chaque nucléotide sur la séquence initiale est représentée par des brins qui se terminent à ce
point par le ddNTP complémentaire. Comme chaque type de ddNTP porte un marqueur fluorescent distinct, on peut
déterminer l’identité des nucléotides de terminaison des nouveaux brins et, finalement, la séquence originale entière.
ADN
(brin matrice)
ADN
(brin matrice)
Sens
du déplacement
des brins
Brin marqué le plus long
Dernier nucléotide
du brin marqué
le plus long
Dernier nucléotide
du brin marqué
le plus court
Brin marqué le plus court
Laser
Détecteur
Brins marqués
Amorce
Désoxyribonucléotides
Didésoxyribonucléotides
(marqués par fluorescence)
ddATP
ddCTP
ddTTP
ddGTP
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
ADN
polymérase
C
T
G
A
C
T
T
C
G
A
C
A
A
T
G
T
T
ddC
T
G
T
T
ddG
C
T
G
T
T
ddA
G
C
T
G
T
T
ddA
A
G
C
T
G
T
T
ddG
A
A
G
C
T
G
T
T
ddT
G
A
A
G
C
T
G
T
T
ddC
T
G
A
A
G
C
T
G
T
T
ddA
C
T
G
A
A
G
C
T
G
T
T
ddG
A
C
T
G
A
A
G
C
T
G
T
T
5؅
5؅
3؅
5؅
Plus long
Plus court
3؅
3؅
C
T
G
A
C
T
T
C
G
A
C
A
A
5؅
3؅
G
A
C
G
A
A
G
C
P P P
OH
G
P P P
H
G
Le fragment d’ADN à séquencer
est dénaturé en brins simples et incubé
dans une éprouvette avec les ingrédients
nécessaires pour la synthèse de l’ADN :
une amorce conçue pour se lier par
des liaisons hydrogène à l’extrémité 3؅
connue du brin matrice, l’ADN polymérase,
les quatre désoxyribonucléotides
et les quatre didésoxyribonucléotides,
chacun étant marqué avec une molécule
fluorescente différente.
1
La synthèse des nouveaux brins
commence à l’extrémité 3؅ de l’amorce
et se poursuit jusqu’à l’insertion
du didésoxyribonucléotide, de façon aléatoire,
à la place du nucléotide normal équivalent.
L’insertion du didésoxyribonucléotide empêche
la poursuite de l’élongation du brin,
alors que celle du nucléotide normal la permet.
Finalement, on obtient un ensemble
de brins marqués, de longueurs différentes.
La couleur du marqueur représente
le dernier nucléotide dans la séquence.
2
3 Les brins d’ADN marqués dans le mélange sont
séparés par passage sur un gel de polyacrylamide ;
les brins plus courts se déplacent plus vite. Pour
le séquençage de l’ADN, le gel est placé dans
un tube capillaire plutôt que sur une plaque
comme celle illustrée à la figure 20.9.
La petite taille du tube permet à un détecteur
de fluorescence de reconnaître la couleur
de chaque marqueur fluorescent à mesure
que les brins traversent le gel. On peut distinguer
l’un de l’autre des brins dont la longueur
ne diffère que d’un seul nucléotide.
T
MéthODe De recher che
résultats  La couleur du marqueur fluorescent
sur chaque brin indique la nature du nucléotide à
son extrémité. Il est possible d’imprimer les résultats sous forme de spectrogramme ; la séquence,
qui est complémentaire au brin matrice, peut être
lue de bas en haut (du brin le plus court vers le
brin le plus long). (Remarquez que la séquence
commence après l’amorce.)