chapitre 20 La biotechnologie
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glucide (glycosylation) ou d’un lipide, ce que les Bactéries sont
incapables de faire. Il arrive même que les levures ne puissent
modifier correctement certaines protéines provenant d’un
mammifère. Il est toutefois possible de faire effectuer ces
modifications par plusieurs types de cellules hôtes mises en
culture. Des résultats satisfaisants ont été obtenus avec certaines lignées cellulaires de mammifères et avec une lignée
cellulaire d’insectes infectées par un virus particulier (baculovirus) contenant de l’ADN recombiné.
En plus des vecteurs, les scientifiques ont mis au point
plusieurs autres méthodes permettant d’introduire de l’ADN
recombiné dans les cellules eucaryotes. C’est le cas de
l’électro poration, qui consiste à soumettre une solution
contenant des cellules à une brève impulsion électrique de
haut voltage. Le courant électrique crée dans la membrane
plasmique des trous temporaires, par lesquels l’ADN peut
pénétrer. (Aujourd’hui, on emploie couramment cette technique dans le cas de bactéries également.) Il est aussi possible
d’injecter l’ADN directement dans les grosses cellules eucaryotes, comme les ovocytes, au moyen d’aiguilles microscopiques. Pour insérer l’ADN dans des cellules végétales, on
peut utiliser Agrobacterium, une bactérie du sol, ou recourir à
d’autres méthodes, comme nous le verrons plus loin. Si
l’ADN inséré est incorporé dans le génome d’une cellule par
recombinaison génétique, alors il peut être exprimé par la
cellule. On peut aussi insérer l’ADN dans des vésicules lipidiques appelées liposomes qui fusionnent avec la membrane
de la cellule et la traversent. Enfin, on peut introduire mécaniquement de l’ADN dans une cellule animale ou végétale à
l’aide d’un « canon à gènes » qui permet de bombarder une
cellule de particules de tungstène ou d’or recouvertes d’ADN.
L’expression génique interspécifique
et l’ascendance évolutive
évolutIon
La capacité à exprimer des protéines d’Eucaryotes dans des bactéries (même si les protéines ne sont pas
correctement glycosylées) est une propriété absolument remarquable quand on considère à quel point les cellules eucaryotes
et les cellules bactériennes sont différentes. Il existe de nombreux exemples de gènes issus d’une espèce donnée qui
demeurent complètement fonctionnels après avoir été transférés dans une autre espèce très différente. Ces observations
soulignent l’ascendance évolutive commune d’espèces vivant
aujourd’hui.
Pour illustrer cette affirmation, prenons l’exemple du gène
Pax6, présent chez des animaux aussi divers que des vertébrés
et des drosophiles. Chez les Vertébrés, le produit du gène Pax6
(la protéine Pax6) déclenche un programme complexe d’expression génique qui aboutit à la formation d’un œil pourvu
d’un seul cristallin. Par contre, chez la drosophile, le gène
Pax6 provoque la formation d’un œil composé, qui est très
différent de celui des Vertébrés. Lorsque les scientifiques ont
cloné le gène Pax6 de souris et l’ont introduit dans un
embryon de drosophile, ils ont constaté avec étonnement
qu’il conduisait à la formation d’un œil composé présent chez
la mouche (voir la figure 50.16, p. 1268). Inversement, le trans
fert du gène Pax6 de la drosophile dans un embryon de Vertébré (une grenouille, dans ce cas) entraînait la formation d’un
œil de grenouille. Bien que les programmes génétiques déclenchés chez les Vertébrés et chez les drosophiles génèrent des
types d’yeux très différents, les deux versions du gène Pax6
peuvent se substituer l’une à l’autre ; c’est là une preuve de leur
évolution à partir d’un gène présent chez un ancêtre commun.
La figure 17.6 (p. 383) présente des exemples plus simples :
un gène de luciole est exprimé dans un plant de tabac, et on
y voit un produit d’un gène de méduse exprimé chez un
porc. Les mécanismes fondamentaux de l’expression génique
ont des racines évolutives anciennes, qui sont la base des
nombreuses tech niques d’ADN recombiné décrites dans le
présent chapitre.
L’amplification de l’aDN in vitro :
l’amplification en chaîne par polymérase (acp)
Le clonage d’ADN dans des cellules demeure à ce jour la
meilleure méthode de production de grandes quantités d’un
gène ou d’une autre séquence d’ADN. Cependant, lorsque la
source d’ADN est peu abondante ou impure, la technique de
l’amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en
anglais PCR, pour polymerase chain reaction) constitue une précieuse solution de rechange. Plus rapide et plus sélective, elle
permet l’amplification (soit la production de nombreuses
copies) in vitro de n’importe quel segment spécifique d’une ou
de plusieurs molécules d’ADN. L’automatisation du processus
permet désormais de produire des milliards de copies d’un segment donné en quelques heures, alors qu’il faut plusieurs jours
pour obtenir le même nombre de copies en criblant une banque
d’ADN afin d’isoler un clone portant le gène recherché et de
le laisser se répliquer dans des cellules hôtes. Mise au point
dans les années 1980 par le biochimiste américain Kary Mullis,
qui a d’ailleurs reçu le prix Nobel de chimie en 1993, l’ACP est
considérée par certains comme une percée aussi importante
pour la biologie que l’invention du microscope. En fait, on a
de plus en plus souvent recours à l’ACP pour produire de
grandes quantités d’un fragment donné d’ADN afin de l’insérer directement dans un vecteur, permettant ainsi de sauter
entièrement les étapes de constitution et de criblage d’une
banque. Pour reprendre l’analogie littéraire, on pourrait dire
que l’ACP consiste à photocopier quelques pages d’un livre
plutôt que de le parcourir en entier dans une bibliothèque.
L’amplification en chaîne par polymérase repose sur la
répétition cyclique d’une réaction en chaîne qui se déroule
en trois étapes et qui accroît le nombre de molécules d’ADN
de façon exponentielle. Au cours de chaque cycle, qui ne dure
que quelques minutes, on chauffe le mélange réactionnel
afin de dénaturer (séparer) les brins d’ADN. Ensuite, on
refroidit pour permettre la renaturation (ou reformation) de
liaisons hydrogène entre de courtes amorces d’ADN monocaténaire et leurs séquences complémentaires sur les brins
opposés à chaque extrémité de la séquence visée. Enfin, une
ADN polymérase résistante à la chaleur allonge les amorces
dans le sens 5 → 3. Si on utilisait une ADN polymérase
normale, la protéine qui constitue cette enzyme serait dénaturée en même temps que l’ADN au moment du chauffage
de la première étape, et il faudrait la remplacer après chaque
cycle. En fait, c’est la découverte d’une ADN polymérase peu
commune, appelée Taq polymérase, qui a permis d’automatiser l’ACP. Le nom de cette enzyme est une abréviation de
Thermus aquaticus, l’espèce bactérienne dont on l’a isolée
pour la première fois. Cette bactérie vit dans des sources
hydrothermales, de sorte que la sélection naturelle a généré
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glucide (glycosylation) ou d’un lipide, ce que les Bactéries sont
incapables de faire. Il arrive même que les levures ne puissent
modifier correctement certaines protéines provenant d’un
mammifère. Il est toutefois possible de faire effectuer ces
modifications par plusieurs types de cellules hôtes mises en
culture. Des résultats satisfaisants ont été obtenus avec certaines lignées cellulaires de mammifères et avec une lignée
cellulaire d’insectes infectées par un virus particulier (baculovirus) contenant de l’ADN recombiné.
En plus des vecteurs, les scientifiques ont mis au point
plusieurs autres méthodes permettant d’introduire de l’ADN
recombiné dans les cellules eucaryotes. C’est le cas de
l’électro poration, qui consiste à soumettre une solution
contenant des cellules à une brève impulsion électrique de
haut voltage. Le courant électrique crée dans la membrane
plasmique des trous temporaires, par lesquels l’ADN peut
pénétrer. (Aujourd’hui, on emploie couramment cette technique dans le cas de bactéries également.) Il est aussi possible
d’injecter l’ADN directement dans les grosses cellules eucaryotes, comme les ovocytes, au moyen d’aiguilles microscopiques. Pour insérer l’ADN dans des cellules végétales, on
peut utiliser Agrobacterium, une bactérie du sol, ou recourir à
d’autres méthodes, comme nous le verrons plus loin. Si
l’ADN inséré est incorporé dans le génome d’une cellule par
recombinaison génétique, alors il peut être exprimé par la
cellule. On peut aussi insérer l’ADN dans des vésicules lipidiques appelées liposomes qui fusionnent avec la membrane
de la cellule et la traversent. Enfin, on peut introduire mécaniquement de l’ADN dans une cellule animale ou végétale à
l’aide d’un « canon à gènes » qui permet de bombarder une
cellule de particules de tungstène ou d’or recouvertes d’ADN.
L’expression génique interspécifique
et l’ascendance évolutive
évolutIon
La capacité à exprimer des protéines d’Eucaryotes dans des bactéries (même si les protéines ne sont pas
correctement glycosylées) est une propriété absolument remarquable quand on considère à quel point les cellules eucaryotes
et les cellules bactériennes sont différentes. Il existe de nombreux exemples de gènes issus d’une espèce donnée qui
demeurent complètement fonctionnels après avoir été transférés dans une autre espèce très différente. Ces observations
soulignent l’ascendance évolutive commune d’espèces vivant
aujourd’hui.
Pour illustrer cette affirmation, prenons l’exemple du gène
Pax6, présent chez des animaux aussi divers que des vertébrés
et des drosophiles. Chez les Vertébrés, le produit du gène Pax6
(la protéine Pax6) déclenche un programme complexe d’expression génique qui aboutit à la formation d’un œil pourvu
d’un seul cristallin. Par contre, chez la drosophile, le gène
Pax6 provoque la formation d’un œil composé, qui est très
différent de celui des Vertébrés. Lorsque les scientifiques ont
cloné le gène Pax6 de souris et l’ont introduit dans un
embryon de drosophile, ils ont constaté avec étonnement
qu’il conduisait à la formation d’un œil composé présent chez
la mouche (voir la figure 50.16, p. 1268). Inversement, le trans
fert du gène Pax6 de la drosophile dans un embryon de Vertébré (une grenouille, dans ce cas) entraînait la formation d’un
œil de grenouille. Bien que les programmes génétiques déclenchés chez les Vertébrés et chez les drosophiles génèrent des
types d’yeux très différents, les deux versions du gène Pax6
peuvent se substituer l’une à l’autre ; c’est là une preuve de leur
évolution à partir d’un gène présent chez un ancêtre commun.
La figure 17.6 (p. 383) présente des exemples plus simples :
un gène de luciole est exprimé dans un plant de tabac, et on
y voit un produit d’un gène de méduse exprimé chez un
porc. Les mécanismes fondamentaux de l’expression génique
ont des racines évolutives anciennes, qui sont la base des
nombreuses tech niques d’ADN recombiné décrites dans le
présent chapitre.
L’amplification de l’aDN in vitro :
l’amplification en chaîne par polymérase (acp)
Le clonage d’ADN dans des cellules demeure à ce jour la
meilleure méthode de production de grandes quantités d’un
gène ou d’une autre séquence d’ADN. Cependant, lorsque la
source d’ADN est peu abondante ou impure, la technique de
l’amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en
anglais PCR, pour polymerase chain reaction) constitue une précieuse solution de rechange. Plus rapide et plus sélective, elle
permet l’amplification (soit la production de nombreuses
copies) in vitro de n’importe quel segment spécifique d’une ou
de plusieurs molécules d’ADN. L’automatisation du processus
permet désormais de produire des milliards de copies d’un segment donné en quelques heures, alors qu’il faut plusieurs jours
pour obtenir le même nombre de copies en criblant une banque
d’ADN afin d’isoler un clone portant le gène recherché et de
le laisser se répliquer dans des cellules hôtes. Mise au point
dans les années 1980 par le biochimiste américain Kary Mullis,
qui a d’ailleurs reçu le prix Nobel de chimie en 1993, l’ACP est
considérée par certains comme une percée aussi importante
pour la biologie que l’invention du microscope. En fait, on a
de plus en plus souvent recours à l’ACP pour produire de
grandes quantités d’un fragment donné d’ADN afin de l’insérer directement dans un vecteur, permettant ainsi de sauter
entièrement les étapes de constitution et de criblage d’une
banque. Pour reprendre l’analogie littéraire, on pourrait dire
que l’ACP consiste à photocopier quelques pages d’un livre
plutôt que de le parcourir en entier dans une bibliothèque.
L’amplification en chaîne par polymérase repose sur la
répétition cyclique d’une réaction en chaîne qui se déroule
en trois étapes et qui accroît le nombre de molécules d’ADN
de façon exponentielle. Au cours de chaque cycle, qui ne dure
que quelques minutes, on chauffe le mélange réactionnel
afin de dénaturer (séparer) les brins d’ADN. Ensuite, on
refroidit pour permettre la renaturation (ou reformation) de
liaisons hydrogène entre de courtes amorces d’ADN monocaténaire et leurs séquences complémentaires sur les brins
opposés à chaque extrémité de la séquence visée. Enfin, une
ADN polymérase résistante à la chaleur allonge les amorces
dans le sens 5 → 3. Si on utilisait une ADN polymérase
normale, la protéine qui constitue cette enzyme serait dénaturée en même temps que l’ADN au moment du chauffage
de la première étape, et il faudrait la remplacer après chaque
cycle. En fait, c’est la découverte d’une ADN polymérase peu
commune, appelée Taq polymérase, qui a permis d’automatiser l’ACP. Le nom de cette enzyme est une abréviation de
Thermus aquaticus, l’espèce bactérienne dont on l’a isolée
pour la première fois. Cette bactérie vit dans des sources
hydrothermales, de sorte que la sélection naturelle a généré