468 trOiSiÈMe partie La génétique
une ADN polymérase qui a l’avantage de
résister aux fortes températures (plus de
90 °C) au début de chaque cycle de l’ACP.
La figure 20.8 illustre les étapes de l’ACP.
La spécificité de l’ACP est tout aussi
étonnante que sa rapidité. Il suffit de
minuscules quantités d’ADN (même s’il
n’est pas intact) dans le matériel de départ,
pourvu que quelques molécules contiennent la séquence visée complète. La clé
de cette grande spécificité réside dans les
amorces qui forment des liaisons hydrogène seulement avec les séquences aux extrémités opposées du segment visé. (Pour une
spécificité élevée, les amorces doivent avoir
une longueur d’au moins 15 nucléotides
environ.) À la fin du troisième cycle, le
quart des molécules est identique au segment visé, les deux brins ayant la longueur
appropriée. À l’issue de chaque cycle successif, on double le nombre de molécules
du segment visé de la bonne longueur ;
celuici s’élève à 2 n , où n représente le
nombre de cycles. Après 30 autres cycles,
on obtient environ un milliard de copies de
la séquence visée !
Malgré sa vitesse et sa spécificité, l’ACP
ne peut pas remplacer le clonage d’un gène
dans des cellules quand ce gène doit être
produit en grande quantité. Des erreurs
occasionnelles surviennent pendant la réplication, ce qui limite le nombre de copies
exactes fournies grâce à cette technique.
Lorsque l’ACP est utilisée pour fabriquer un
fragment d’ADN spéci fique afin de le cloner,
il faut séquencer les clones produits afin
d’éliminer tous ceux qui comportent des
séquences erronées. Les erreurs de l’ACP
imposent également des limites à la longueur des fragments d’ADN qui peuvent
être copiés.
Conçue en 1985, l’amplification en
chaîne par polymérase a eu de grandes
répercussions sur les domaines de la
recherche biologique et de la biotechnologie. On s’en sert pour amplifier de l’ADN
de provenances très diverses : d’une momie
découverte dans une pyramide, d’un mammouth laineux congelé depuis 40 000 ans,
d’empreintes digitales ou de minuscules
échantillons de sang, de tissu ou de sperme
prélevés sur les lieux d’un crime, d’une cellule embryonnaire unique dans le but de
poser un diagnostic prénatal rapide de
maladies géné tiques, de gènes viraux provenant de cellules infectées par des virus
difficiles à détecter (comme le VIH), etc.
Nous reparlerons des applications de l’ACP
plus loin dans le chapitre.
. Figure 20.8
L’amplification en chaîne par polymérase (acp)
applICatIon L’ACP permet de produire un grand nombre de fois des copies d’un segment
donné d’ADN (la séquence visée). Elle se déroule entièrement in vitro.
teCHnIQue L’ACP nécessite un ADN bicaténaire contenant la séquence visée, une ADN polymérase résistante à la chaleur, les quatre nucléotides ainsi que deux brins d’ADN de 15 à 20 nucléotides
qui servent d’amorces. Une amorce est complémentaire à une extrémité de la séquence recherchée
sur un brin ; la seconde est complémentaire à l’autre extrémité de la séquence sur l’autre brin.
5
3
3
5
5
3
3
5
Séquence
visée
ADN génomique
Amorces
Cycle 1
Production
de 2 molécules
Cycle 2
Production
de 4 molécules
Cycle 3
Production
de 8 molécules ;
2 molécules
(dans les
rectangles blancs)
correspondent à
la séquence visée.
Nouveaux
nucléotides
Dénaturation :
chauffage pendant
une courte période
pour séparer
les brins d’ADN.
1
Hybridation :
refroidissement
permettant aux amorces
de former des liaisons
hydrogène avec
les extrémités
de la séquence visée.
2
Élongation :
ajout de nucléotides
par l’ADN polymérase
à l’extrémité 3
de chaque amorce.
3
résultats Après trois cycles, deux molécules correspondent exactement à la séquence visée. Après
30 autres cycles, le nombre de molécules correspondant à la séquence visée dépasse le milliard (10
9
).
MéthODe De recher che
une ADN polymérase qui a l’avantage de
résister aux fortes températures (plus de
90 °C) au début de chaque cycle de l’ACP.
La figure 20.8 illustre les étapes de l’ACP.
La spécificité de l’ACP est tout aussi
étonnante que sa rapidité. Il suffit de
minuscules quantités d’ADN (même s’il
n’est pas intact) dans le matériel de départ,
pourvu que quelques molécules contiennent la séquence visée complète. La clé
de cette grande spécificité réside dans les
amorces qui forment des liaisons hydrogène seulement avec les séquences aux extrémités opposées du segment visé. (Pour une
spécificité élevée, les amorces doivent avoir
une longueur d’au moins 15 nucléotides
environ.) À la fin du troisième cycle, le
quart des molécules est identique au segment visé, les deux brins ayant la longueur
appropriée. À l’issue de chaque cycle successif, on double le nombre de molécules
du segment visé de la bonne longueur ;
celuici s’élève à 2 n , où n représente le
nombre de cycles. Après 30 autres cycles,
on obtient environ un milliard de copies de
la séquence visée !
Malgré sa vitesse et sa spécificité, l’ACP
ne peut pas remplacer le clonage d’un gène
dans des cellules quand ce gène doit être
produit en grande quantité. Des erreurs
occasionnelles surviennent pendant la réplication, ce qui limite le nombre de copies
exactes fournies grâce à cette technique.
Lorsque l’ACP est utilisée pour fabriquer un
fragment d’ADN spéci fique afin de le cloner,
il faut séquencer les clones produits afin
d’éliminer tous ceux qui comportent des
séquences erronées. Les erreurs de l’ACP
imposent également des limites à la longueur des fragments d’ADN qui peuvent
être copiés.
Conçue en 1985, l’amplification en
chaîne par polymérase a eu de grandes
répercussions sur les domaines de la
recherche biologique et de la biotechnologie. On s’en sert pour amplifier de l’ADN
de provenances très diverses : d’une momie
découverte dans une pyramide, d’un mammouth laineux congelé depuis 40 000 ans,
d’empreintes digitales ou de minuscules
échantillons de sang, de tissu ou de sperme
prélevés sur les lieux d’un crime, d’une cellule embryonnaire unique dans le but de
poser un diagnostic prénatal rapide de
maladies géné tiques, de gènes viraux provenant de cellules infectées par des virus
difficiles à détecter (comme le VIH), etc.
Nous reparlerons des applications de l’ACP
plus loin dans le chapitre.
. Figure 20.8
L’amplification en chaîne par polymérase (acp)
applICatIon L’ACP permet de produire un grand nombre de fois des copies d’un segment
donné d’ADN (la séquence visée). Elle se déroule entièrement in vitro.
teCHnIQue L’ACP nécessite un ADN bicaténaire contenant la séquence visée, une ADN polymérase résistante à la chaleur, les quatre nucléotides ainsi que deux brins d’ADN de 15 à 20 nucléotides
qui servent d’amorces. Une amorce est complémentaire à une extrémité de la séquence recherchée
sur un brin ; la seconde est complémentaire à l’autre extrémité de la séquence sur l’autre brin.
5
3
3
5
5
3
3
5
Séquence
visée
ADN génomique
Amorces
Cycle 1
Production
de 2 molécules
Cycle 2
Production
de 4 molécules
Cycle 3
Production
de 8 molécules ;
2 molécules
(dans les
rectangles blancs)
correspondent à
la séquence visée.
Nouveaux
nucléotides
Dénaturation :
chauffage pendant
une courte période
pour séparer
les brins d’ADN.
1
Hybridation :
refroidissement
permettant aux amorces
de former des liaisons
hydrogène avec
les extrémités
de la séquence visée.
2
Élongation :
ajout de nucléotides
par l’ADN polymérase
à l’extrémité 3
de chaque amorce.
3
résultats Après trois cycles, deux molécules correspondent exactement à la séquence visée. Après
30 autres cycles, le nombre de molécules correspondant à la séquence visée dépasse le milliard (10
9
).
MéthODe De recher che