466 trOiSiÈMe partie La génétique
les cellules bactériennes sont dépourvues d’outils d’épissage
de l’ARN, elles sont incapables de traduire ces gènes correctement. On peut résoudre toutefois ce problème en utilisant
une forme d’ADNc du gène qui ne contient que les exons.
Le clonage et les systèmes d’expression eucaryotes
Les biologistes moléculaires peuvent pallier l’incompatibilité
entre Eucaryotes et Bactéries en remplaçant les bactéries par
des cellules eucaryotes qui servent d’hôtes pour le clonage ou
l’expression (ou les deux) de gènes d’Eucaryotes. Les levures
(champignons unicellulaires) offrent plusieurs avantages à
cet égard : elles sont aussi faciles à cultiver que les bactéries ;
elles se divisent rapidement (en quelques heures), et elles présentent un très grand nombre de formes phénotypiques distinctes. De plus, elles contiennent des plasmides, ce qui est
rare chez les Eucaryotes. Les scientifiques ont même conçu
des plasmides recombinés contenant à la fois de l’ADN de
levure et de bactérie, et capables de se répliquer dans l’un
ou l’autre de ces deux types de cellules.
Un autre facteur joue en faveur de l’emploi de cellules eucaryotes en tant qu’hôtes servant à l’expression de gènes clonés
d’Eucaryotes. Rappelezvous que, pour êtres fonctionnelles,
de nombreuses protéines d’Eucaryotes doivent être modifiées
après leur traduction, par exemple par l’incor poration d’un
. Figure 20.7
La détection d’une séquence d’aDN spécifique par hybridation moléculaire
avec une sonde nucléique
applICatIon L’hybridation moléculaire à l’aide d’une sonde nucléique complémentaire permet de détecter une séquence d’ADN spécifique dans un mélange de molécules d’ADN. Dans cet exemple, on crible
un ensemble de clones bactériens provenant d’une banque génomique
de colibri afin de trouver les clones renfermant un plasmide recombiné
porteur du gène recherché.
teCHnIQue On dépose des cellules de chaque clone sur une membrane
de nylon spéciale. Chaque membrane possède assez d’espace pour des milliers de clones (beaucoup plus que ceux qui sont illustrés ici), de sorte qu’il
suffit de quelques membranes seulement pour analyser les échantillons de
tous les clones de la banque. Cet ensemble de membranes est une banque
de clones disposés en grille qui peut être criblée pour un gène donné à
l’aide d’une sonde marquée. Ici, le marqueur est un nucléotide radioactif,
mais on utilise d’autres types de marqueurs qui se fixent aux nucléotides de
la sonde en établissant des liaisons covalentes. Il s’agit de composés fluorescents (émission de fluorescence) ou d’enzymes qui produisent une substance colorée ou luminescente.
1 Plaque par plaque, les cellules de chaque
puits, représentant un clone, sont transférées
en un point donné sur une membrane
de nylon spéciale. Les échantillons placés
sur la membrane de nylon sont traités afin
d’ouvrir les cellules et de dénaturer leur ADN.
Les brins d’ADN monocaténaire ainsi obtenus
adhèrent à la membrane.
2 On met alors à incuber la membrane dans
une solution de molécules d’une sonde radioactive
complémentaires au gène recherché. Comme l’ADN
immobilisé sur la membrane est monocaténaire,
la sonde monocaténaire que l’on vient d’ajouter
s’associe par appariement de bases avec un ADN
complémentaire présent sur la membrane. L’excès
d’ADN est éliminé par rinçage. (Un point contenant
des complexes hybrides de sonde radioactive-ADN
a été coloré en orange, mais on ne peut encore
distinguer la couleur à cette étape.)
3 On place la membrane sous une pellicule
photographique sensible aux rayons X qui
enregistre la position de toutes les zones
radioactives. Sur cette pellicule, les points noirs
correspondent aux endroits sur la membrane
où se trouve l’ADN qui s’est hybridé avec
la sonde. Chaque point peut être relié au puits
d’origine contenant le clone bactérien
qui porte le gène recherché.
Plaques multipuits
contenant
la banque de clones
Sac en plastique contenant
une suspension de molécules
de la sonde marquée à l’aide
d’un isotope radioactif
Gène
recherché
ADN
de la sonde
Emplacement
de l’ADN
portant
la séquence
complémentaire
Membrane
de nylon
Pellicule
ADN monocaténaire
provenant
de la cellule
Membrane de nylon
… CTCATCACCGGC …
GAGTAGTGGCCG
5
3
5
3
résultats Pour une sonde radioactive, l’emplacement du point noir sur la plaque photographique révèle
le clone contenant le gène recherché. (Les sondes marquées par d’autres moyens utilisent d’autres systèmes
de détection.) L’utilisation de sondes ayant des séquences nucléotidiques différentes dans des expériences
différentes permet aux chercheurs de cribler la collection de clones bactériens pour différents gènes.
MéthODe De recher che
les cellules bactériennes sont dépourvues d’outils d’épissage
de l’ARN, elles sont incapables de traduire ces gènes correctement. On peut résoudre toutefois ce problème en utilisant
une forme d’ADNc du gène qui ne contient que les exons.
Le clonage et les systèmes d’expression eucaryotes
Les biologistes moléculaires peuvent pallier l’incompatibilité
entre Eucaryotes et Bactéries en remplaçant les bactéries par
des cellules eucaryotes qui servent d’hôtes pour le clonage ou
l’expression (ou les deux) de gènes d’Eucaryotes. Les levures
(champignons unicellulaires) offrent plusieurs avantages à
cet égard : elles sont aussi faciles à cultiver que les bactéries ;
elles se divisent rapidement (en quelques heures), et elles présentent un très grand nombre de formes phénotypiques distinctes. De plus, elles contiennent des plasmides, ce qui est
rare chez les Eucaryotes. Les scientifiques ont même conçu
des plasmides recombinés contenant à la fois de l’ADN de
levure et de bactérie, et capables de se répliquer dans l’un
ou l’autre de ces deux types de cellules.
Un autre facteur joue en faveur de l’emploi de cellules eucaryotes en tant qu’hôtes servant à l’expression de gènes clonés
d’Eucaryotes. Rappelezvous que, pour êtres fonctionnelles,
de nombreuses protéines d’Eucaryotes doivent être modifiées
après leur traduction, par exemple par l’incor poration d’un
. Figure 20.7
La détection d’une séquence d’aDN spécifique par hybridation moléculaire
avec une sonde nucléique
applICatIon L’hybridation moléculaire à l’aide d’une sonde nucléique complémentaire permet de détecter une séquence d’ADN spécifique dans un mélange de molécules d’ADN. Dans cet exemple, on crible
un ensemble de clones bactériens provenant d’une banque génomique
de colibri afin de trouver les clones renfermant un plasmide recombiné
porteur du gène recherché.
teCHnIQue On dépose des cellules de chaque clone sur une membrane
de nylon spéciale. Chaque membrane possède assez d’espace pour des milliers de clones (beaucoup plus que ceux qui sont illustrés ici), de sorte qu’il
suffit de quelques membranes seulement pour analyser les échantillons de
tous les clones de la banque. Cet ensemble de membranes est une banque
de clones disposés en grille qui peut être criblée pour un gène donné à
l’aide d’une sonde marquée. Ici, le marqueur est un nucléotide radioactif,
mais on utilise d’autres types de marqueurs qui se fixent aux nucléotides de
la sonde en établissant des liaisons covalentes. Il s’agit de composés fluorescents (émission de fluorescence) ou d’enzymes qui produisent une substance colorée ou luminescente.
1 Plaque par plaque, les cellules de chaque
puits, représentant un clone, sont transférées
en un point donné sur une membrane
de nylon spéciale. Les échantillons placés
sur la membrane de nylon sont traités afin
d’ouvrir les cellules et de dénaturer leur ADN.
Les brins d’ADN monocaténaire ainsi obtenus
adhèrent à la membrane.
2 On met alors à incuber la membrane dans
une solution de molécules d’une sonde radioactive
complémentaires au gène recherché. Comme l’ADN
immobilisé sur la membrane est monocaténaire,
la sonde monocaténaire que l’on vient d’ajouter
s’associe par appariement de bases avec un ADN
complémentaire présent sur la membrane. L’excès
d’ADN est éliminé par rinçage. (Un point contenant
des complexes hybrides de sonde radioactive-ADN
a été coloré en orange, mais on ne peut encore
distinguer la couleur à cette étape.)
3 On place la membrane sous une pellicule
photographique sensible aux rayons X qui
enregistre la position de toutes les zones
radioactives. Sur cette pellicule, les points noirs
correspondent aux endroits sur la membrane
où se trouve l’ADN qui s’est hybridé avec
la sonde. Chaque point peut être relié au puits
d’origine contenant le clone bactérien
qui porte le gène recherché.
Plaques multipuits
contenant
la banque de clones
Sac en plastique contenant
une suspension de molécules
de la sonde marquée à l’aide
d’un isotope radioactif
Gène
recherché
ADN
de la sonde
Emplacement
de l’ADN
portant
la séquence
complémentaire
Membrane
de nylon
Pellicule
ADN monocaténaire
provenant
de la cellule
Membrane de nylon
… CTCATCACCGGC …
GAGTAGTGGCCG
5
3
5
3
résultats Pour une sonde radioactive, l’emplacement du point noir sur la plaque photographique révèle
le clone contenant le gène recherché. (Les sondes marquées par d’autres moyens utilisent d’autres systèmes
de détection.) L’utilisation de sondes ayant des séquences nucléotidiques différentes dans des expériences
différentes permet aux chercheurs de cribler la collection de clones bactériens pour différents gènes.
MéthODe De recher che