464 trOiSiÈMe partie La génétique
transférer que des séquences inférieures à 10 kb (figure 20.5b).
La très grande taille des séquences diminue le nombre de clones
nécessaires pour constituer la banque génomique, mais elle
complique leur manipulation au laboratoire. C’est pourquoi il
arrive que l’on coupe ensuite la séquence en plus petits morceaux qui sont « sousclonés » en vecteurs plasmidiques.
Les clones sont généralement entreposés sur des plaques
multipuits en plastique, chaque puits contenant un clone
(figure 20.5c). Cet entreposage ordonné des clones, identifiés par leur situation sur la plaque, rend très efficace la sélection du gène recherché, comme nous allons le voir.
Dans une banque génomique, le gène cloné de la bglobine
ne comporterait pas que les exons contenant la séquence
codante, mais aussi le promoteur, les régions non traduites et
les introns. Certains biologistes pourraient être intéressés par
la protéine bglobine ellemême ; ils pourraient se demander,
par exemple, si cette protéine qui transporte l’oxygène est différente de sa contrepartie dans d’autres espèces au métabolisme moins actif. Ces chercheurs pourraient constituer un
autre type de banque d’ADN à partir d’ARNm ayant subi une
maturation extrait de cellules dans lesquelles le gène est
exprimé (figure 20.6). Une enzyme, la transcriptase inverse
(extraite d’un rétro virus) est utilisée in vitro pour fabriquer un
transcrit inverse d’ADN monocaténaire à partir de chaque
molécule d’ARNm. Il faut se rap peler que l’extrémité 3 de
l’ARNm porte un segment de ribonucléotides d’adénine (A)
appelé queue polyA. Cette caractéristique permet d’utiliser
un court brin de désoxythymidine (dT) comme amorce
pour la transcriptase inverse. Après la dégradation enzymatique de l’ARNm, l’ADN polymérase synthétise un second
brin d’ADN, complémentaire du premier. L’ADN bicaténaire
qui en résulte est appelé ADN complé mentaire (ADNc).
Pour créer une banque génomique, les chercheurs doivent
modifier l’ADNc en ajoutant, à chacune de ses extrémités,
des séquences de reconnaissance de l’enzyme de restriction.
L’ADNc est alors inséré dans l’ADN vecteur comme on le
fait pour les fragments d’ADN géno mique. L’ARNm isolé est
en fait un mélange de toutes les molécules d’ARNm dans
les cel lules d’origine, transcrites à partir de divers gènes de
la cellule. Par conséquent, les ADNc clonés constituent une
banque d’ADNc renfermant une collection de gènes.
Cependant, une banque d’ADNc ne représente qu’une partie
du génome de l’organisme (elle ne contient que la portion
des gènes transcrits dans les cellules à partir desquelles l’ARNm
a été isolé).
Les banques génomiques et les banques d’ADNc pré sentent
chacune leur avantage ; tout dépend des objectifs poursuivis.
Si on veut cloner un gène et qu’on ne sait pas dans quel type
de cellules il est exprimé ou qu’on est incapable d’obtenir
suffisamment de cellules du type approprié, il faut privilégier
la banque génomique, car il est à peu
près certain qu’elle contient le gène.
Il en sera de même si l’on veut étudier
les séquences régulatrices ou les introns
associés à un gène, car ces séquences
sont absentes des ARNm utilisés pour
constituer une banque d’ADNc. Par
contre, pour étudier une protéine
spécifique (comme la bglobine), une
banque d’ADNc produite à partir de
cellules exprimant le gène (comme
les globules rouges) est idéale. Une
banque d’ADNc peut être tout aussi
utile pour étudier des ensembles de
gènes exprimés dans des types donnés de cellules, comme celles du cerveau ou du foie. Enfin, les chercheurs
peuvent recon naître les changements
de l’expression génique au cours du
développement en fabriquant de l’ADNc
à partir de cellules du même type prélevées à différents stades de la vie
d’un organisme.
En plus des banques d’ADN, les
chercheurs peuvent aussi utiliser des
gènes synthétiques, fabriqués en laboratoire. En effet, si on connaît la séquence
des acides aminés de la protéine transcrite par un ADN, il est tout à fait possible d’assembler dans le bon ordre les
nucléotides de cet ADN. Ainsi, à partir
de la séquence connue des 51 acides
aminés composant les deux chaînes de
la molécule d’insuline humaine, on a
réussi, en 1979, à synthétiser le gène
m Figure 20.5 Les banques génomiques. Une banque génomique comprend un grand nombre
de clones. Chacun contient des copies d’un segment d’ADN issu d’un génome étranger, intégrées dans
un vecteur d’ADN approprié, comme un plasmide ou un chromosome bactérien artificiel. Dans une banque
génomique complète (banque d’ADN), les segments d’ADN étranger couvrent tout le génome d’un organisme. Notez que dans cette figure les chromosomes bactériens ne sont pas représentés à l’échelle ;
en réalité, ils sont environ 1 000 fois plus gros que les vecteurs.
Clones
plasmidiques
Plasmides
recombinés
en petits
fragments
en gros
fragments
Chromosome bactérien
artificiel (CBA)
Grandes
séquences
avec de
nombreux
gènes
découpé par des enzymes de restriction
Génome étranger
ou
(a) Banque génomique plasmidique.
On a représenté ici trois « échantillons »
parmi les milliers qui constituent la banque
génomique plasmidique. Chacun est un clone
de cellules bactériennes contenant des copies
d’un certain fragment du génome étranger
(coloré en rose, en jaune ou en noir) dans
son plasmide recombiné.
(c) Entreposage des banques génomiques.
Les banques génomiques plasmidiques
et de chromosomes artificiels bactériens
sont généralement entreposées sur une plaque
multipuits en plastique (la plaque a 384 puits).
Chaque clone occupe un puits.
(La banque d’un génome complet
nécessite un grand nombre de ces plaques.)
(b) Clone de chromosome bactérien
artificiel. De nombreux clones
de chromosomes bactériens
artificiels constituent une banque.
transférer que des séquences inférieures à 10 kb (figure 20.5b).
La très grande taille des séquences diminue le nombre de clones
nécessaires pour constituer la banque génomique, mais elle
complique leur manipulation au laboratoire. C’est pourquoi il
arrive que l’on coupe ensuite la séquence en plus petits morceaux qui sont « sousclonés » en vecteurs plasmidiques.
Les clones sont généralement entreposés sur des plaques
multipuits en plastique, chaque puits contenant un clone
(figure 20.5c). Cet entreposage ordonné des clones, identifiés par leur situation sur la plaque, rend très efficace la sélection du gène recherché, comme nous allons le voir.
Dans une banque génomique, le gène cloné de la bglobine
ne comporterait pas que les exons contenant la séquence
codante, mais aussi le promoteur, les régions non traduites et
les introns. Certains biologistes pourraient être intéressés par
la protéine bglobine ellemême ; ils pourraient se demander,
par exemple, si cette protéine qui transporte l’oxygène est différente de sa contrepartie dans d’autres espèces au métabolisme moins actif. Ces chercheurs pourraient constituer un
autre type de banque d’ADN à partir d’ARNm ayant subi une
maturation extrait de cellules dans lesquelles le gène est
exprimé (figure 20.6). Une enzyme, la transcriptase inverse
(extraite d’un rétro virus) est utilisée in vitro pour fabriquer un
transcrit inverse d’ADN monocaténaire à partir de chaque
molécule d’ARNm. Il faut se rap peler que l’extrémité 3 de
l’ARNm porte un segment de ribonucléotides d’adénine (A)
appelé queue polyA. Cette caractéristique permet d’utiliser
un court brin de désoxythymidine (dT) comme amorce
pour la transcriptase inverse. Après la dégradation enzymatique de l’ARNm, l’ADN polymérase synthétise un second
brin d’ADN, complémentaire du premier. L’ADN bicaténaire
qui en résulte est appelé ADN complé mentaire (ADNc).
Pour créer une banque génomique, les chercheurs doivent
modifier l’ADNc en ajoutant, à chacune de ses extrémités,
des séquences de reconnaissance de l’enzyme de restriction.
L’ADNc est alors inséré dans l’ADN vecteur comme on le
fait pour les fragments d’ADN géno mique. L’ARNm isolé est
en fait un mélange de toutes les molécules d’ARNm dans
les cel lules d’origine, transcrites à partir de divers gènes de
la cellule. Par conséquent, les ADNc clonés constituent une
banque d’ADNc renfermant une collection de gènes.
Cependant, une banque d’ADNc ne représente qu’une partie
du génome de l’organisme (elle ne contient que la portion
des gènes transcrits dans les cellules à partir desquelles l’ARNm
a été isolé).
Les banques génomiques et les banques d’ADNc pré sentent
chacune leur avantage ; tout dépend des objectifs poursuivis.
Si on veut cloner un gène et qu’on ne sait pas dans quel type
de cellules il est exprimé ou qu’on est incapable d’obtenir
suffisamment de cellules du type approprié, il faut privilégier
la banque génomique, car il est à peu
près certain qu’elle contient le gène.
Il en sera de même si l’on veut étudier
les séquences régulatrices ou les introns
associés à un gène, car ces séquences
sont absentes des ARNm utilisés pour
constituer une banque d’ADNc. Par
contre, pour étudier une protéine
spécifique (comme la bglobine), une
banque d’ADNc produite à partir de
cellules exprimant le gène (comme
les globules rouges) est idéale. Une
banque d’ADNc peut être tout aussi
utile pour étudier des ensembles de
gènes exprimés dans des types donnés de cellules, comme celles du cerveau ou du foie. Enfin, les chercheurs
peuvent recon naître les changements
de l’expression génique au cours du
développement en fabriquant de l’ADNc
à partir de cellules du même type prélevées à différents stades de la vie
d’un organisme.
En plus des banques d’ADN, les
chercheurs peuvent aussi utiliser des
gènes synthétiques, fabriqués en laboratoire. En effet, si on connaît la séquence
des acides aminés de la protéine transcrite par un ADN, il est tout à fait possible d’assembler dans le bon ordre les
nucléotides de cet ADN. Ainsi, à partir
de la séquence connue des 51 acides
aminés composant les deux chaînes de
la molécule d’insuline humaine, on a
réussi, en 1979, à synthétiser le gène
m Figure 20.5 Les banques génomiques. Une banque génomique comprend un grand nombre
de clones. Chacun contient des copies d’un segment d’ADN issu d’un génome étranger, intégrées dans
un vecteur d’ADN approprié, comme un plasmide ou un chromosome bactérien artificiel. Dans une banque
génomique complète (banque d’ADN), les segments d’ADN étranger couvrent tout le génome d’un organisme. Notez que dans cette figure les chromosomes bactériens ne sont pas représentés à l’échelle ;
en réalité, ils sont environ 1 000 fois plus gros que les vecteurs.
Clones
plasmidiques
Plasmides
recombinés
en petits
fragments
en gros
fragments
Chromosome bactérien
artificiel (CBA)
Grandes
séquences
avec de
nombreux
gènes
découpé par des enzymes de restriction
Génome étranger
ou
(a) Banque génomique plasmidique.
On a représenté ici trois « échantillons »
parmi les milliers qui constituent la banque
génomique plasmidique. Chacun est un clone
de cellules bactériennes contenant des copies
d’un certain fragment du génome étranger
(coloré en rose, en jaune ou en noir) dans
son plasmide recombiné.
(c) Entreposage des banques génomiques.
Les banques génomiques plasmidiques
et de chromosomes artificiels bactériens
sont généralement entreposées sur une plaque
multipuits en plastique (la plaque a 384 puits).
Chaque clone occupe un puits.
(La banque d’un génome complet
nécessite un grand nombre de ces plaques.)
(b) Clone de chromosome bactérien
artificiel. De nombreux clones
de chromosomes bactériens
artificiels constituent une banque.