chapitre 20 La biotechnologie
463
pour trouver la colonie (clone cellulaire)
ou les colonies portant les séquences du
gène de la bglobine parmi les nombreux
clones contenant d’autres morceaux de
l’ADN du colibri. Pour comprendre cette
procédure, nous devons d’abord examiner
comment les gènes sont entreposés.
L’entreposage de gènes clonés
dans des banques d’ADN
La procédure de clonage génique illustrée à
la figure 20.4, qui porte sur un mélange de
fragments issus de l’ensemble du génome
d’un organisme, est appelée procédure « en
aveugle », car elle ne cherche pas à obtenir
un gène en particulier. L’étape 3 produit
de nombreux plasmides recombinés différents. À l’étape 5, chaque colonie blanche
correspond à un clone différent de cellules,
chacun d’eux renfermant un type de plasmides qui contient une copie d’un segment particulier du génome initial. Chaque
« clone de plasmides » de cette banque
génomique renferme des informations
spécifiques (figure 20.5a). Aujourd’hui,
les scientifiques obtiennent souvent une
banque génomique (ou même des gènes
clonés particuliers) d’un autre chercheur,
d’une source commerciale ou d’un centre
de séquençage.
Historiquement, certains bactériophages
ont également servi de vecteurs de clonage
pour constituer des banques génomiques.
Il est possible d’insérer des fragments
d’ADN étranger dans une version réduite
d’un génome phagique comme dans un
plasmide, c’estàdire par épissage, à l’aide
d’une enzyme de restriction et d’une ADN
ligase. Le processus normal d’infection
permet de produire de nombreuses particules phagiques nouvelles, portant toutes
la séquence de l’ADN étranger. Aujourd’hui,
les phages sont généralement utilisés pour
constituer des banques génomiques seulement dans des cas spéciaux.
Un chromosome bactérien artificiel (CBA ou BAC, pour bacterial artificial
chromosome) est un autre type de vecteur
largement utilisé pour constituer des
banques génomiques. Malgré son nom, il
s’agit de gros plasmides dont on a éliminé
un certain nombre de gènes pour ne
conserver que les éléments nécessaires à la
réplication. Un des intérêts de ces chromosomes artificiels bactériens comme vecteurs
réside dans leur capacité de transporter
une séquence d’ADN de 100 à 300 kb
(1 kb équivalant à 1 000 paires de bases),
alors qu’un plasmide normal ne peut
. Figure 20.4
Le clonage de gènes dans des plasmides bactériens
Plasmide bactérien
(vecteur de clonage)
Site
de restriction
Gène
recherché
Plasmides recombinés
Plasmide
non recombiné
Bactéries contenant
des plasmides
Colonie portant
un plasmide
non recombiné
ayant un gène
lacZ intact
Colonie portant
un plasmide recombiné
ayant un gène lacZ
interrompu
Fragments
d’ADN
du colibri
Extrémités
cohésives
Cellule de colibri
Gène amp
R
(résistance
à l’ampicilline)
Gène lacZ
(dégradation
du lactose)
Un des
nombreux clones
bactériens
Obtention de l’ADN modifié
du plasmide et de l’ADN
du colibri à partir
de cellules de colibri.
L’ADN du colibri
contient le gène
recherché.
1
Découpage des deux échantillons d’ADN
avec la même enzyme de restriction,
qui ne coupe qu’à un seul site
dans le gène lacZ et
à de nombreux endroits
dans l’ADN du colibri.
2
Mélange des morceaux de plasmides
et des fragments d’ADN. Certains
s’associent par appariement de leurs bases ;
l’ajout d’ADN ligase permet de les souder.
Les produits sont des plasmides recombinés
et de nombreux plasmides non recombinés.
3
Mélange de l’ADN avec les cellules bactériennes
dont le gène lacZ a subi une mutation.
Certaines cellules absorberont un plasmide
recombinant ou une autre molécule d’ADN
par transformation.
4
Bactéries étalées sur une gélose nutritive
contenant de l’ampicilline et du X-gal,
une molécule qui ressemble au lactose.
Incubation jusqu’à la croissance de colonies.
5
MéthODe De recher che
résultats Seules les cellules qui ont absorbé un
plasmide contenant le gène amp
R sont capables
de se reproduire et de former une colonie. Les
colonies renfermant des plasmides non recombinés
sont bleues parce qu’elles peuvent hydrolyser le
X-gal, pour donner un produit bleu. Les colonies
contenant des plasmides recombinés, dans lesquels
lacZ est interrompu, sont blanches, parce qu’elles
ne peuvent pas hydrolyser le X-gal.
et sI ?
Si le milieu utilisé à l’étape 5 ne
contient pas d’ampicilline, quelles autres colonies
pourraient se développer ? De quelle couleur
seraient-elles ?
applICatIon Le clonage de gènes est un processus qui produit de nombreuses copies d’un gène
recherché. Ces copies peuvent servir à séquencer le gène, en produisant sa protéine encodée, ou être
utilisées comme matériel en recherche fondamentale ou pour d’autres applications.
teCHnIQue Dans cet exemple, les gènes du colibri sont insérés dans un plasmide provenant
d’E. coli. Seulement trois plasmides et trois fragments d’ADN du colibri sont illustrés, mais, dans la réalité,
les échantillons contiendraient des millions de copies du plasmide et un mélange
hétérogène formé de plusieurs millions de fragments d’ADN du colibri.
463
pour trouver la colonie (clone cellulaire)
ou les colonies portant les séquences du
gène de la bglobine parmi les nombreux
clones contenant d’autres morceaux de
l’ADN du colibri. Pour comprendre cette
procédure, nous devons d’abord examiner
comment les gènes sont entreposés.
L’entreposage de gènes clonés
dans des banques d’ADN
La procédure de clonage génique illustrée à
la figure 20.4, qui porte sur un mélange de
fragments issus de l’ensemble du génome
d’un organisme, est appelée procédure « en
aveugle », car elle ne cherche pas à obtenir
un gène en particulier. L’étape 3 produit
de nombreux plasmides recombinés différents. À l’étape 5, chaque colonie blanche
correspond à un clone différent de cellules,
chacun d’eux renfermant un type de plasmides qui contient une copie d’un segment particulier du génome initial. Chaque
« clone de plasmides » de cette banque
génomique renferme des informations
spécifiques (figure 20.5a). Aujourd’hui,
les scientifiques obtiennent souvent une
banque génomique (ou même des gènes
clonés particuliers) d’un autre chercheur,
d’une source commerciale ou d’un centre
de séquençage.
Historiquement, certains bactériophages
ont également servi de vecteurs de clonage
pour constituer des banques génomiques.
Il est possible d’insérer des fragments
d’ADN étranger dans une version réduite
d’un génome phagique comme dans un
plasmide, c’estàdire par épissage, à l’aide
d’une enzyme de restriction et d’une ADN
ligase. Le processus normal d’infection
permet de produire de nombreuses particules phagiques nouvelles, portant toutes
la séquence de l’ADN étranger. Aujourd’hui,
les phages sont généralement utilisés pour
constituer des banques génomiques seulement dans des cas spéciaux.
Un chromosome bactérien artificiel (CBA ou BAC, pour bacterial artificial
chromosome) est un autre type de vecteur
largement utilisé pour constituer des
banques génomiques. Malgré son nom, il
s’agit de gros plasmides dont on a éliminé
un certain nombre de gènes pour ne
conserver que les éléments nécessaires à la
réplication. Un des intérêts de ces chromosomes artificiels bactériens comme vecteurs
réside dans leur capacité de transporter
une séquence d’ADN de 100 à 300 kb
(1 kb équivalant à 1 000 paires de bases),
alors qu’un plasmide normal ne peut
. Figure 20.4
Le clonage de gènes dans des plasmides bactériens
Plasmide bactérien
(vecteur de clonage)
Site
de restriction
Gène
recherché
Plasmides recombinés
Plasmide
non recombiné
Bactéries contenant
des plasmides
Colonie portant
un plasmide
non recombiné
ayant un gène
lacZ intact
Colonie portant
un plasmide recombiné
ayant un gène lacZ
interrompu
Fragments
d’ADN
du colibri
Extrémités
cohésives
Cellule de colibri
Gène amp
R
(résistance
à l’ampicilline)
Gène lacZ
(dégradation
du lactose)
Un des
nombreux clones
bactériens
Obtention de l’ADN modifié
du plasmide et de l’ADN
du colibri à partir
de cellules de colibri.
L’ADN du colibri
contient le gène
recherché.
1
Découpage des deux échantillons d’ADN
avec la même enzyme de restriction,
qui ne coupe qu’à un seul site
dans le gène lacZ et
à de nombreux endroits
dans l’ADN du colibri.
2
Mélange des morceaux de plasmides
et des fragments d’ADN. Certains
s’associent par appariement de leurs bases ;
l’ajout d’ADN ligase permet de les souder.
Les produits sont des plasmides recombinés
et de nombreux plasmides non recombinés.
3
Mélange de l’ADN avec les cellules bactériennes
dont le gène lacZ a subi une mutation.
Certaines cellules absorberont un plasmide
recombinant ou une autre molécule d’ADN
par transformation.
4
Bactéries étalées sur une gélose nutritive
contenant de l’ampicilline et du X-gal,
une molécule qui ressemble au lactose.
Incubation jusqu’à la croissance de colonies.
5
MéthODe De recher che
résultats Seules les cellules qui ont absorbé un
plasmide contenant le gène amp
R sont capables
de se reproduire et de former une colonie. Les
colonies renfermant des plasmides non recombinés
sont bleues parce qu’elles peuvent hydrolyser le
X-gal, pour donner un produit bleu. Les colonies
contenant des plasmides recombinés, dans lesquels
lacZ est interrompu, sont blanches, parce qu’elles
ne peuvent pas hydrolyser le X-gal.
et sI ?
Si le milieu utilisé à l’étape 5 ne
contient pas d’ampicilline, quelles autres colonies
pourraient se développer ? De quelle couleur
seraient-elles ?
applICatIon Le clonage de gènes est un processus qui produit de nombreuses copies d’un gène
recherché. Ces copies peuvent servir à séquencer le gène, en produisant sa protéine encodée, ou être
utilisées comme matériel en recherche fondamentale ou pour d’autres applications.
teCHnIQue Dans cet exemple, les gènes du colibri sont insérés dans un plasmide provenant
d’E. coli. Seulement trois plasmides et trois fragments d’ADN du colibri sont illustrés, mais, dans la réalité,
les échantillons contiendraient des millions de copies du plasmide et un mélange
hétérogène formé de plusieurs millions de fragments d’ADN du colibri.