462 trOiSiÈMe partie La génétique
Certaines enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau
de la même paire de bases (coupure franche), mais celles
qui sont les plus utiles coupent les squelettes désoxyribosephosphate dans les deux brins d’ADN de façon décalée,
comme le montre la figure 20.3 ; les fragments de restriction
bicaténaires ont alors au moins une extrémité monocaténaire, appelée extrémité cohésive. Les bases de ces courts
prolongements forment des liaisons hydrogène avec les parties
monocaténaires complémentaires portées par d’autres molécules d’ADN découpées par la même enzyme. Les ensembles
ainsi constitués sont temporaires. Cependant, ces liaisons
peuvent devenir per manentes sous l’effet d’une enzyme
appelée ADN ligase. Comme vous l’avez vu à la figure 16.16,
une ligase catalyse la formation de liaisons covalentes qui
referment les squelettes désoxyribosephosphate des brins
d’ADN ; par exemple, elle lie les fragments d’Okazaki au
cours de la réplication. Comme on peut le voir au bas de la
figure 20.3, l’association cata lysée par la ligase de l’ADN provenant de deux sources distinctes produit une molécule
d’ADN recombiné stable.
La procédure de clonage d’un gène
d’eucaryote dans un plasmide bactérien
Maintenant que vous connaissez les enzymes de restriction
et l’ADN ligase, examinons comment les gènes sont clonés
dans les plasmides. Le plasmide d’origine est appelé vecteur
de clonage ; sa molécule d’ADN servira à introduire un
ADN étranger dans une cellule hôte et en permettra la réplication. Les plasmides bactériens sont largement utilisés en
tant que vecteurs de clonage pour plusieurs raisons. On peut
facilement les obtenir de four nisseurs commerciaux, les
manipuler pour former des plasmides recombinés par insertion d’ADN étranger in vitro et ensuite les replacer dans des
cellules bactériennes. En outre, les plasmides bactériens
recombinés (et l’ADN étranger qu’ils transportent) se reproduisent rapidement grâce à la vitesse de reproduction élevée
de leurs cellules hôtes.
La production de clones cellulaires
contenant des plasmides recombinés
Supposons que nous soyons des chercheurs intéressés par
l’étude du gène de la bglobine chez une espèce particulière de
colibri. Il faut commencer par cloner tous les gènes du colibri
et ensuite isoler le gène de la bglobine de tous les autres,
une tâche ardue, qui équivaut à rechercher une aiguille dans
une botte de foin. La figure 20.4 montre en détail une technique de clonage des gènes du colibri en utilisant un plasmide
bactérien comme vecteur de clonage.
1 On commence par isoler l’ADN génomique du colibri
à partir de cellules de colibri. On obtient également le plasmide bactérien choisi comme vecteur à partir de cellules
d’E. coli ; il est modifié pour contenir deux gènes qui seront
utiles par la suite. L’un de ces gènes est amp
R
, qui rend E. coli
résistant à l’ampicilline (un antibiotique) ; l’autre gène, lacZ,
code pour la bgalactosidase, l’enzyme qui hydrolyse le lactose (voir p. 411). Le lacZ hydrolyse aussi un analogue
moléculaire de synthèse appelé Xgal, ce qui entraîne la formation d’un produit bleu. Le plasmide ne contient qu’une
seule copie du site de restriction reconnu par l’enzyme de
restriction utilisée à l’étape suivante, et ce site est situé à
l’intérieur du gène lacZ (les plasmides n’ont qu’un seul site
de restriction).
2 La même enzyme de restriction coupe le plasmide et
l’ADN du colibri. 3 On mélange ensuite les fragments, ce qui
permet à leurs extrémités cohésives complémentaires de s’associer par appariement des bases. Puis on ajoute de l’ADN ligase
afin de lier les squelettes désoxyribosephosphate. Il en résulte
des plasmides recombinés dont un grand nombre contiennent
des fragments d’ADN du colibri (comme les trois illustrés à
la figure 20.4), et on s’attend à ce qu’au moins l’un d’eux
contienne tout le gène de la bglobine ou une partie. À cette
étape, il se formera également d’autres produits, tels qu’un
plasmide contenant plusieurs fragments d’ADN du colibri,
une combinaison de deux plasmides ou une version non
recombinée du plasmide d’origine qui se reforme.
4 On ajoute alors le mélange d’ADN à des bactéries dont
le gène lacZ a muté sur leur propre chromosome, ce qui les
empêche d’hydrolyser le lactose ou le Xgal. Dans des conditions expérimentales appropriées, les cellules absorbent
l’ADN étranger par transformation (voir p. 354). Certaines
cellules acquièrent un plasmide recombiné portant un gène,
alors que d’autres cellules absorbent un plasmide non recombiné, un fragment d’ADN non codant de colibri ou rien du
tout. Les gènes amp
R
et lacZ sur le plasmide peuvent nous
aider à distinguer ces possibilités.
5 Premièrement, en ensemençant des bactéries sur une
gélose contenant de l’ampicilline, on peut distinguer les cellules qui ont absorbé les plasmides, qu’ils soient recombinés ou
non, provenant des autres cellules. En effet, seules les cellules
pos sédant un plasmide sont capables de se reproduire parce
qu’elles portent le gène amp
R
de la résistance à l’ampicilline
dans le milieu nutritif. Chaque bactérie viable donne alors
naissance à un clone. Lorsqu’il contient entre 10
5
et 10
8
cellules, le clone est visible sur l’agar sous forme de masse, ou
colonie. À mesure que les cellules se reproduisent, tout gène
étranger porté par un plasmide recombiné est également
copié (cloné).
Deuxièmement, la présence de Xgal dans le milieu permet
de distinguer les colonies dont les bactéries possèdent des plasmides recombinés de celles qui ont des plasmides non recombinés. Ces dernières portent le gène lacZ dans son intégrité et
produisent la bgalactosidase fonctionnelle. Ces colonies sont
bleues parce que l’enzyme hydrolyse le Xgal dans le milieu en
un produit bleu. En revanche, les colonies qui contiennent des
plasmides recombinés portant un ADN étranger inséré dans le
gène lacZ ne produisent pas de bgalactosidase fonctionnelle ;
par conséquent, ces colonies sont blanches.
Avec la méthode que nous venons de décrire, nous sommes
arrivés à cloner un grand nombre de fragments différents
d’ADN du colibri, mais pas seulement celui de la bglobine,
qui nous intéresse. En fait, prises dans leur ensemble, les
colonies blanches doivent représenter toutes les séquences
d’ADN du génome du colibri, incluant aussi bien les régions
non codantes que les gènes euxmêmes. De plus, étant donné
que les enzymes de restriction ne reconnaissent pas les limites
des gènes, certains gènes sont découpés et répartis entre deux
clones ou plus. Nous aborderons sous peu la procédure utilisée
Certaines enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau
de la même paire de bases (coupure franche), mais celles
qui sont les plus utiles coupent les squelettes désoxyribosephosphate dans les deux brins d’ADN de façon décalée,
comme le montre la figure 20.3 ; les fragments de restriction
bicaténaires ont alors au moins une extrémité monocaténaire, appelée extrémité cohésive. Les bases de ces courts
prolongements forment des liaisons hydrogène avec les parties
monocaténaires complémentaires portées par d’autres molécules d’ADN découpées par la même enzyme. Les ensembles
ainsi constitués sont temporaires. Cependant, ces liaisons
peuvent devenir per manentes sous l’effet d’une enzyme
appelée ADN ligase. Comme vous l’avez vu à la figure 16.16,
une ligase catalyse la formation de liaisons covalentes qui
referment les squelettes désoxyribosephosphate des brins
d’ADN ; par exemple, elle lie les fragments d’Okazaki au
cours de la réplication. Comme on peut le voir au bas de la
figure 20.3, l’association cata lysée par la ligase de l’ADN provenant de deux sources distinctes produit une molécule
d’ADN recombiné stable.
La procédure de clonage d’un gène
d’eucaryote dans un plasmide bactérien
Maintenant que vous connaissez les enzymes de restriction
et l’ADN ligase, examinons comment les gènes sont clonés
dans les plasmides. Le plasmide d’origine est appelé vecteur
de clonage ; sa molécule d’ADN servira à introduire un
ADN étranger dans une cellule hôte et en permettra la réplication. Les plasmides bactériens sont largement utilisés en
tant que vecteurs de clonage pour plusieurs raisons. On peut
facilement les obtenir de four nisseurs commerciaux, les
manipuler pour former des plasmides recombinés par insertion d’ADN étranger in vitro et ensuite les replacer dans des
cellules bactériennes. En outre, les plasmides bactériens
recombinés (et l’ADN étranger qu’ils transportent) se reproduisent rapidement grâce à la vitesse de reproduction élevée
de leurs cellules hôtes.
La production de clones cellulaires
contenant des plasmides recombinés
Supposons que nous soyons des chercheurs intéressés par
l’étude du gène de la bglobine chez une espèce particulière de
colibri. Il faut commencer par cloner tous les gènes du colibri
et ensuite isoler le gène de la bglobine de tous les autres,
une tâche ardue, qui équivaut à rechercher une aiguille dans
une botte de foin. La figure 20.4 montre en détail une technique de clonage des gènes du colibri en utilisant un plasmide
bactérien comme vecteur de clonage.
1 On commence par isoler l’ADN génomique du colibri
à partir de cellules de colibri. On obtient également le plasmide bactérien choisi comme vecteur à partir de cellules
d’E. coli ; il est modifié pour contenir deux gènes qui seront
utiles par la suite. L’un de ces gènes est amp
R
, qui rend E. coli
résistant à l’ampicilline (un antibiotique) ; l’autre gène, lacZ,
code pour la bgalactosidase, l’enzyme qui hydrolyse le lactose (voir p. 411). Le lacZ hydrolyse aussi un analogue
moléculaire de synthèse appelé Xgal, ce qui entraîne la formation d’un produit bleu. Le plasmide ne contient qu’une
seule copie du site de restriction reconnu par l’enzyme de
restriction utilisée à l’étape suivante, et ce site est situé à
l’intérieur du gène lacZ (les plasmides n’ont qu’un seul site
de restriction).
2 La même enzyme de restriction coupe le plasmide et
l’ADN du colibri. 3 On mélange ensuite les fragments, ce qui
permet à leurs extrémités cohésives complémentaires de s’associer par appariement des bases. Puis on ajoute de l’ADN ligase
afin de lier les squelettes désoxyribosephosphate. Il en résulte
des plasmides recombinés dont un grand nombre contiennent
des fragments d’ADN du colibri (comme les trois illustrés à
la figure 20.4), et on s’attend à ce qu’au moins l’un d’eux
contienne tout le gène de la bglobine ou une partie. À cette
étape, il se formera également d’autres produits, tels qu’un
plasmide contenant plusieurs fragments d’ADN du colibri,
une combinaison de deux plasmides ou une version non
recombinée du plasmide d’origine qui se reforme.
4 On ajoute alors le mélange d’ADN à des bactéries dont
le gène lacZ a muté sur leur propre chromosome, ce qui les
empêche d’hydrolyser le lactose ou le Xgal. Dans des conditions expérimentales appropriées, les cellules absorbent
l’ADN étranger par transformation (voir p. 354). Certaines
cellules acquièrent un plasmide recombiné portant un gène,
alors que d’autres cellules absorbent un plasmide non recombiné, un fragment d’ADN non codant de colibri ou rien du
tout. Les gènes amp
R
et lacZ sur le plasmide peuvent nous
aider à distinguer ces possibilités.
5 Premièrement, en ensemençant des bactéries sur une
gélose contenant de l’ampicilline, on peut distinguer les cellules qui ont absorbé les plasmides, qu’ils soient recombinés ou
non, provenant des autres cellules. En effet, seules les cellules
pos sédant un plasmide sont capables de se reproduire parce
qu’elles portent le gène amp
R
de la résistance à l’ampicilline
dans le milieu nutritif. Chaque bactérie viable donne alors
naissance à un clone. Lorsqu’il contient entre 10
5
et 10
8
cellules, le clone est visible sur l’agar sous forme de masse, ou
colonie. À mesure que les cellules se reproduisent, tout gène
étranger porté par un plasmide recombiné est également
copié (cloné).
Deuxièmement, la présence de Xgal dans le milieu permet
de distinguer les colonies dont les bactéries possèdent des plasmides recombinés de celles qui ont des plasmides non recombinés. Ces dernières portent le gène lacZ dans son intégrité et
produisent la bgalactosidase fonctionnelle. Ces colonies sont
bleues parce que l’enzyme hydrolyse le Xgal dans le milieu en
un produit bleu. En revanche, les colonies qui contiennent des
plasmides recombinés portant un ADN étranger inséré dans le
gène lacZ ne produisent pas de bgalactosidase fonctionnelle ;
par conséquent, ces colonies sont blanches.
Avec la méthode que nous venons de décrire, nous sommes
arrivés à cloner un grand nombre de fragments différents
d’ADN du colibri, mais pas seulement celui de la bglobine,
qui nous intéresse. En fait, prises dans leur ensemble, les
colonies blanches doivent représenter toutes les séquences
d’ADN du génome du colibri, incluant aussi bien les régions
non codantes que les gènes euxmêmes. De plus, étant donné
que les enzymes de restriction ne reconnaissent pas les limites
des gènes, certains gènes sont découpés et répartis entre deux
clones ou plus. Nous aborderons sous peu la procédure utilisée