chapitre 20 La biotechnologie
461
première cellule se multiplie grâce à des divisions cellulaires
répétées pour former un clone de cellules, une popu lation de
cellules génétiquement identiques. L’ADN étranger et tous les
gènes qu’il porte sont clonés simultanément, puisqu’en se divisant la bactérie réplique le plasmide recombiné et le transmet
à ses descendants. La production d’un grand nombre de copies
du gène est appelée clonage génique.
Le clonage génique sert à deux fins importantes : fabriquer
un grand nombre de copies d’un gène particulier (amplification) et produire une protéine. À partir des bactéries, les chercheurs peuvent donc isoler des copies d’un gène cloné dont ils
se serviront pour procéder à des recherches fondamentales. Ils
pourront également tenter de doter un organisme de nouvelles
capacités métaboliques, par exemple une résistance aux ravageurs. Ainsi, il est possible d’isoler un gène de résistance présent dans une plante donnée et de le transférer à une autre
espèce. C’est aussi grâce à ce procédé que l’on a réussi à récolter
de grandes quantités d’une protéine utile en médecine, l’hormone de croissance humaine, à partir de cultures bactériennes
contenant le gène cloné pour cette protéine.
Un gène constitue généralement une très petite partie de
l’ADN total contenu dans une cellule. Par exemple, dans une
cellule humaine, un gène typique ne représente qu’environ un
millionième de l’ADN. Il est donc crucial de pouvoir amplifier
des fragments d’ADN peu abondants pour toute application
mettant en jeu un gène unique.
L’utilisation d’enzymes de restriction
dans la fabrication d’aDN recombiné
Le clonage génique et plusieurs techniques du génie génétique font appel à des enzymes qui découpent les molé cules
d’ADN en des sites cibles spécifiques, ce qui donne un nombre
limité de segments bien précis. Ces enzymes, appelées en
zymes de restriction ou endonucléases de restriction, ont
été identifiées à la fin des années 1960 par des biologistes
effectuant des recherches fondamentales sur des bactéries. Ils
ont alors montré que ces enzymes particulières protégeaient
la cellule bactérienne en coupant l’ADN étranger provenant
d’autres organismes ou de phages (voir le chapitre 19). Avant
cette découverte, il fallait s’en remettre aux ultrasons ou à
l’agitation mécanique, des méthodes plus ou moins fiables.
À ce jour, on a trouvé et isolé des centaines d’enzymes de
restriction. Chaque enzyme de restriction est très spécifique ;
elle reconnaît une courte séquence particulière d’ADN, appelée
site de restriction, et coupe les deux brins d’ADN en des
points précis dans ce site. L’ADN d’une cellule bactérienne
est protégé de ses propres enzymes de restriction par l’ajout,
au cours de la réplication de l’ADN, de groupements méthyle
(—CH 3 ) aux adénines et aux cytosines des séquences pouvant
être reconnues par les enzymes.
Le schéma du haut de la figure 20.3 montre un site de
restriction reconnu par une certaine enzyme de restriction
isolée chez E. coli. Comme on peut le voir dans cet exemple,
la plupart des sites de restriction sont symétriques et, dans
ce casci, donnent des palindromes (ou séquences pouvant
être lues dans les deux sens, comme le mot Laval). Autrement
dit, les deux brins portent la même séquence de nucléotides
lue dans la direction 5 → 3. Les enzymes de restriction les
plus couramment utilisées reconnaissent des séquences
conte nant de quatre à huit nucléotides. Étant donné qu’une
séquence aussi courte se répète habituellement (par hasard)
plusieurs fois sur une longue molécule d’ADN, l’enzyme
coupe celleci en de nombreux endroits, produisant un
ensemble de fragments de restriction ; par exemple,
l’enzyme EcoR1 reconnaît une séquence qui est présente
toutes les 4 000 paires de bases environ. Le traitement des
copies d’une molécule d’ADN par une enzyme donnée produit toujours le même ensemble de fragments de restriction. En d’autres mots, l’enzyme de restric tion coupe la
molécule d’ADN de façon reproductible. (Nous verrons plus
loin comment ces différents fragments peuvent être séparés
et distingués les uns des autres.)
m Figure 20.3 La production d’un ADN recombiné à l’aide d’une
enzyme de restriction et d’ADN ligase. Dans cet exemple, l’enzyme de
restriction (appelée EcoR1 pour « Escherichia coli restriction 1 ») reconnaît une
séquence de six paires de bases, qui constitue le site de restriction. EcoR1
effectue des coupures décalées dans le squelette désoxyribose-phosphate
de la séquence et produit ainsi des fragments aux extrémités cohésives. Ces
extrémités cohésives complémentaires établissent des liaisons entre les bases,
incluant celles des deux fragments d’origine ; si les fragments proviennent de
sources différentes, le produit ligaturé qui en résulte est un ADN recombiné.
FaItes un dessIn L’enzyme de restriction appelée Hind III reconnaît la
séquence 5-AAGCTT-3, et coupe entre les deux adénines (A). Dessinez la
séquence à double brin bicaténaire avant et après les coupures de l’enzyme.
G
G
C T TA A
A AT T C
G
A A T T C
G
G
C T T A A
G
C
C
G
Fragment de restriction
d’une molécule d’ADN
différente coupée par
la même enzyme de restriction
Une des combinaisons possibles
Extrémité
cohésive
Site de restriction
ADN
5
5
5
3
3
5
3
5
5
3
5
3
3
3
3
5
3
5
3
5
3
5 3
5 3
3
5
5
3
3
5
5
Molécule d’ADN recombiné
A A T T C
C T T A A G
G A AT T C
C T TA A G
A AT T
T TA A
Découpage du squelette
désoxyribose-phosphate
par l’enzyme de restriction
à chaque flèche
1
Ajout d’un fragment d’ADN
provenant d’une autre source ;
les extrémités cohésives
s’associent par appariement
des bases, produisant
diverses combinaisons.
2
Soudure des brins
par l’ADN ligase
3
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première cellule se multiplie grâce à des divisions cellulaires
répétées pour former un clone de cellules, une popu lation de
cellules génétiquement identiques. L’ADN étranger et tous les
gènes qu’il porte sont clonés simultanément, puisqu’en se divisant la bactérie réplique le plasmide recombiné et le transmet
à ses descendants. La production d’un grand nombre de copies
du gène est appelée clonage génique.
Le clonage génique sert à deux fins importantes : fabriquer
un grand nombre de copies d’un gène particulier (amplification) et produire une protéine. À partir des bactéries, les chercheurs peuvent donc isoler des copies d’un gène cloné dont ils
se serviront pour procéder à des recherches fondamentales. Ils
pourront également tenter de doter un organisme de nouvelles
capacités métaboliques, par exemple une résistance aux ravageurs. Ainsi, il est possible d’isoler un gène de résistance présent dans une plante donnée et de le transférer à une autre
espèce. C’est aussi grâce à ce procédé que l’on a réussi à récolter
de grandes quantités d’une protéine utile en médecine, l’hormone de croissance humaine, à partir de cultures bactériennes
contenant le gène cloné pour cette protéine.
Un gène constitue généralement une très petite partie de
l’ADN total contenu dans une cellule. Par exemple, dans une
cellule humaine, un gène typique ne représente qu’environ un
millionième de l’ADN. Il est donc crucial de pouvoir amplifier
des fragments d’ADN peu abondants pour toute application
mettant en jeu un gène unique.
L’utilisation d’enzymes de restriction
dans la fabrication d’aDN recombiné
Le clonage génique et plusieurs techniques du génie génétique font appel à des enzymes qui découpent les molé cules
d’ADN en des sites cibles spécifiques, ce qui donne un nombre
limité de segments bien précis. Ces enzymes, appelées en
zymes de restriction ou endonucléases de restriction, ont
été identifiées à la fin des années 1960 par des biologistes
effectuant des recherches fondamentales sur des bactéries. Ils
ont alors montré que ces enzymes particulières protégeaient
la cellule bactérienne en coupant l’ADN étranger provenant
d’autres organismes ou de phages (voir le chapitre 19). Avant
cette découverte, il fallait s’en remettre aux ultrasons ou à
l’agitation mécanique, des méthodes plus ou moins fiables.
À ce jour, on a trouvé et isolé des centaines d’enzymes de
restriction. Chaque enzyme de restriction est très spécifique ;
elle reconnaît une courte séquence particulière d’ADN, appelée
site de restriction, et coupe les deux brins d’ADN en des
points précis dans ce site. L’ADN d’une cellule bactérienne
est protégé de ses propres enzymes de restriction par l’ajout,
au cours de la réplication de l’ADN, de groupements méthyle
(—CH 3 ) aux adénines et aux cytosines des séquences pouvant
être reconnues par les enzymes.
Le schéma du haut de la figure 20.3 montre un site de
restriction reconnu par une certaine enzyme de restriction
isolée chez E. coli. Comme on peut le voir dans cet exemple,
la plupart des sites de restriction sont symétriques et, dans
ce casci, donnent des palindromes (ou séquences pouvant
être lues dans les deux sens, comme le mot Laval). Autrement
dit, les deux brins portent la même séquence de nucléotides
lue dans la direction 5 → 3. Les enzymes de restriction les
plus couramment utilisées reconnaissent des séquences
conte nant de quatre à huit nucléotides. Étant donné qu’une
séquence aussi courte se répète habituellement (par hasard)
plusieurs fois sur une longue molécule d’ADN, l’enzyme
coupe celleci en de nombreux endroits, produisant un
ensemble de fragments de restriction ; par exemple,
l’enzyme EcoR1 reconnaît une séquence qui est présente
toutes les 4 000 paires de bases environ. Le traitement des
copies d’une molécule d’ADN par une enzyme donnée produit toujours le même ensemble de fragments de restriction. En d’autres mots, l’enzyme de restric tion coupe la
molécule d’ADN de façon reproductible. (Nous verrons plus
loin comment ces différents fragments peuvent être séparés
et distingués les uns des autres.)
m Figure 20.3 La production d’un ADN recombiné à l’aide d’une
enzyme de restriction et d’ADN ligase. Dans cet exemple, l’enzyme de
restriction (appelée EcoR1 pour « Escherichia coli restriction 1 ») reconnaît une
séquence de six paires de bases, qui constitue le site de restriction. EcoR1
effectue des coupures décalées dans le squelette désoxyribose-phosphate
de la séquence et produit ainsi des fragments aux extrémités cohésives. Ces
extrémités cohésives complémentaires établissent des liaisons entre les bases,
incluant celles des deux fragments d’origine ; si les fragments proviennent de
sources différentes, le produit ligaturé qui en résulte est un ADN recombiné.
FaItes un dessIn L’enzyme de restriction appelée Hind III reconnaît la
séquence 5-AAGCTT-3, et coupe entre les deux adénines (A). Dessinez la
séquence à double brin bicaténaire avant et après les coupures de l’enzyme.
G
G
C T TA A
A AT T C
G
A A T T C
G
G
C T T A A
G
C
C
G
Fragment de restriction
d’une molécule d’ADN
différente coupée par
la même enzyme de restriction
Une des combinaisons possibles
Extrémité
cohésive
Site de restriction
ADN
5
5
5
3
3
5
3
5
5
3
5
3
3
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3
5
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5 3
3
5
5
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Molécule d’ADN recombiné
A A T T C
C T T A A G
G A AT T C
C T TA A G
A AT T
T TA A
Découpage du squelette
désoxyribose-phosphate
par l’enzyme de restriction
à chaque flèche
1
Ajout d’un fragment d’ADN
provenant d’une autre source ;
les extrémités cohésives
s’associent par appariement
des bases, produisant
diverses combinaisons.
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Soudure des brins
par l’ADN ligase
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