11 – LES RÉACTIONS RAPIDES
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tests (test de BRADFORD, mesure de l'absorbance dans l'ultraviolet) sont des
mesures de concentration des protéines et sont dès lors peu spécifiques sauf si
l'enzyme est pur et entièrement actif. L'équation [11.10] montre que, si nous pouvons disposer d'un substrat pour lequel k 3 est petit ou nul, alors la taille du burst, p,
est bien définie et égale à la concentration du site actif. Les substrats de la
chymotrypsine utilisés dans les premières études de cet enzyme, le carbonate de
p-nitrophényléthyle et l'acétate de p-nitrophényle, ont des valeurs de k 3 trop élevées, mais par la suite, SCHONBAUM, ZERNER et BENDER (1961) ont montré que
dans des conditions adéquates, le trans-cinnamoylimidazole donne d'excellents
résultats. A pH 5,5 ce composé réagit avec la chymotrypsine pour donner de
l'imidazole et la trans-cinnamoyl-chymotrypsine, mais la réaction ne se poursuit
pas, c'est-à-dire que k 3 0
≈ . Ainsi la mesure de la quantité d'imidazole libérée pour
une solution de chymotrypsine donne une mesure précise de la quantité d'enzyme.
Le titrage du site actif par mesure du burst diffère des mesures de vitesse en étant
relativement insensible aux modifications des constantes de vitesse : une mesure de
vitesse exige des conditions bien définies de pH, de température, de composition
du tampon… pour assurer sa reproductibilité. Par opposition, la taille du burst n'est
pas affectée par des variations relativement importantes de k 2 , qui pourraient, par
exemple, résulter de la modification chimique de l'enzyme, sauf si k 2 diminue au
point d'avoir une valeur comparable à celle de k 3 . Mesurée de cette manière, la
modification chimique d'un enzyme n'affecte pas la mesure de la molarité de
l'enzyme ou la rend égale à zéro. Pour cette raison, le titrage des enzymes a été appelé une méthode de « tout ou rien » (KOSHLAND, STRUMEYER et RAY, 1962).
11.3. LES TECHNIQUES EXPÉRIMENTALES
11.3.1. Les classes de méthodes
Les expériences à l'état stationnaire sont habituellement réalisées sur une échelle de
temps de plusieurs minutes, au minimum. Elles n'ont pas nécessité le développement d'un équipement spécial, parce que, en principe, toute méthode qui permet
l'analyse d'un mélange réactionnel à l'équilibre peut être adaptée pour permettre
l'analyse du déroulement d'une réaction. Dans l'étude des réactions rapides, cependant, les courtes périodes de temps sur lesquelles les mesures doivent être réalisées
ont nécessité le développement d'appareils spéciaux, et ne se présentent donc pas
comme une simple extension de celles des réactions à l'état stationnaire.
Les échelles de temps typiques des processus importants pour comprendre les
réactions catalysées par des enzymes couvrent la gamme allant d'environ 10 ps pour
les réactions les plus rapides de transfert de proton ou d'électron jusqu'aux secondes
pour les réactions spécifiques les plus lentes catalysées par des enzymes, ou plus
longues – minutes ou heures – pour les réactions avec des substrats non-spécifiques,
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tests (test de BRADFORD, mesure de l'absorbance dans l'ultraviolet) sont des
mesures de concentration des protéines et sont dès lors peu spécifiques sauf si
l'enzyme est pur et entièrement actif. L'équation [11.10] montre que, si nous pouvons disposer d'un substrat pour lequel k 3 est petit ou nul, alors la taille du burst, p,
est bien définie et égale à la concentration du site actif. Les substrats de la
chymotrypsine utilisés dans les premières études de cet enzyme, le carbonate de
p-nitrophényléthyle et l'acétate de p-nitrophényle, ont des valeurs de k 3 trop élevées, mais par la suite, SCHONBAUM, ZERNER et BENDER (1961) ont montré que
dans des conditions adéquates, le trans-cinnamoylimidazole donne d'excellents
résultats. A pH 5,5 ce composé réagit avec la chymotrypsine pour donner de
l'imidazole et la trans-cinnamoyl-chymotrypsine, mais la réaction ne se poursuit
pas, c'est-à-dire que k 3 0
≈ . Ainsi la mesure de la quantité d'imidazole libérée pour
une solution de chymotrypsine donne une mesure précise de la quantité d'enzyme.
Le titrage du site actif par mesure du burst diffère des mesures de vitesse en étant
relativement insensible aux modifications des constantes de vitesse : une mesure de
vitesse exige des conditions bien définies de pH, de température, de composition
du tampon… pour assurer sa reproductibilité. Par opposition, la taille du burst n'est
pas affectée par des variations relativement importantes de k 2 , qui pourraient, par
exemple, résulter de la modification chimique de l'enzyme, sauf si k 2 diminue au
point d'avoir une valeur comparable à celle de k 3 . Mesurée de cette manière, la
modification chimique d'un enzyme n'affecte pas la mesure de la molarité de
l'enzyme ou la rend égale à zéro. Pour cette raison, le titrage des enzymes a été appelé une méthode de « tout ou rien » (KOSHLAND, STRUMEYER et RAY, 1962).
11.3. LES TECHNIQUES EXPÉRIMENTALES
11.3.1. Les classes de méthodes
Les expériences à l'état stationnaire sont habituellement réalisées sur une échelle de
temps de plusieurs minutes, au minimum. Elles n'ont pas nécessité le développement d'un équipement spécial, parce que, en principe, toute méthode qui permet
l'analyse d'un mélange réactionnel à l'équilibre peut être adaptée pour permettre
l'analyse du déroulement d'une réaction. Dans l'étude des réactions rapides, cependant, les courtes périodes de temps sur lesquelles les mesures doivent être réalisées
ont nécessité le développement d'appareils spéciaux, et ne se présentent donc pas
comme une simple extension de celles des réactions à l'état stationnaire.
Les échelles de temps typiques des processus importants pour comprendre les
réactions catalysées par des enzymes couvrent la gamme allant d'environ 10 ps pour
les réactions les plus rapides de transfert de proton ou d'électron jusqu'aux secondes
pour les réactions spécifiques les plus lentes catalysées par des enzymes, ou plus
longues – minutes ou heures – pour les réactions avec des substrats non-spécifiques,