7 – UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'ÉTUDE DES MÉCANISMES ENZYMATIQUES
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sujets à d'importantes erreurs, car la théorie complète de l'origine des effets
isotopiques sur les cinétiques est beaucoup plus compliquée que nous ne l'avons
décrite ci-dessus. Toutefois, il apparaît que les effets du deutérium et du tritium
dévient souvent de manière consistante des valeurs prédites, mais elles sont
toujours reliées entre elles par la relation suivante (SWAIN et al., 1958) :
k
k
k
k
H
H
H
H
1
3
1
2
1 442
=
⎛
⎝
⎜
⎞
⎠
⎟
,
[7.18]
7.6.2. Effets isotopiques secondaires
En discutant la raison des effets primaires d'isotopes, nous avons supposé que la
conversion de l'état fondamental en un état de transition affecte uniquement la
liaison qui est étirée dans la réaction, mais cette vision est trop simpliste. En réalité,
la molécule entière est affectée, mais dans des proportions qui diminuent rapidement à mesure qu'on s'éloigne du site de réaction. Pour les liaisons adjacentes à
celle qui est rompue, les niveaux d'énergie de vibration sont un peu plus proches
les uns des autres pour les différents isotopes qu'ils ne le sont dans l'état fondamental. Ainsi, alors que les différences isotopiques s'éliminent presque entièrement,
une faible différence résiduelle persiste dans l'enthalpie d'activation entre
1 H et
2 H.
Celle-ci provoque une faible différence dans la vitesse, appelée un effet isotopique
secondaire. De tels effets sont typiquement de l'ordre de 1,3, c'est-à-dire que les
réactions impliquant un
2 H fixé à l'un des atomes réagissant sont typiquement
environ 30% plus lentes que les réactions correspondantes impliquant
1 H.
La grandeur de ces effets isotopiques secondaires les rend plus difficiles à mesurer
que les effets primaires, et probablement pour cette raison, ils ont été assez peu
utilisés en enzymologie. Ils peuvent cependant fournir des informations mécaniques utiles, difficilement accessibles par d'autres mesures. De nombreux mécanismes proposés à la fois pour des réactions chimiques ordinaires et pour des
réactions catalysées par des enzymes, impliquent un changement de coordination
du carbone (comme par exemple le passage d'un état tétraédrique à un état trigonal)
quand l'état de transition est formé, et ce changement peut être détecté comme un
effet isotopique secondaire par la substitution isotopique d'un atome d'hydrogène
fixé à l'atome de carbone qui est impliqué dans la réaction, même si la liaison
C – H, responsable de l'effet isotopique n'est pas modifiée par la réaction. Ce type
d'approche a été utilisé, par exemple, dans l'étude de la β-galactosidase (SINNOTT
et SOUCHARD, 1973).
7.6.3. Effets isotopiques sur les équilibres
Essentiellement les mêmes arguments s'appliquent aux effets isotopiques sur les
équilibres qu'aux effets isotopiques secondaires : les effets de substitutions isotopiques sur les niveaux d'énergie s'opèrent dans des directions opposées sur les
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sujets à d'importantes erreurs, car la théorie complète de l'origine des effets
isotopiques sur les cinétiques est beaucoup plus compliquée que nous ne l'avons
décrite ci-dessus. Toutefois, il apparaît que les effets du deutérium et du tritium
dévient souvent de manière consistante des valeurs prédites, mais elles sont
toujours reliées entre elles par la relation suivante (SWAIN et al., 1958) :
k
k
k
k
H
H
H
H
1
3
1
2
1 442
=
⎛
⎝
⎜
⎞
⎠
⎟
,
[7.18]
7.6.2. Effets isotopiques secondaires
En discutant la raison des effets primaires d'isotopes, nous avons supposé que la
conversion de l'état fondamental en un état de transition affecte uniquement la
liaison qui est étirée dans la réaction, mais cette vision est trop simpliste. En réalité,
la molécule entière est affectée, mais dans des proportions qui diminuent rapidement à mesure qu'on s'éloigne du site de réaction. Pour les liaisons adjacentes à
celle qui est rompue, les niveaux d'énergie de vibration sont un peu plus proches
les uns des autres pour les différents isotopes qu'ils ne le sont dans l'état fondamental. Ainsi, alors que les différences isotopiques s'éliminent presque entièrement,
une faible différence résiduelle persiste dans l'enthalpie d'activation entre
1 H et
2 H.
Celle-ci provoque une faible différence dans la vitesse, appelée un effet isotopique
secondaire. De tels effets sont typiquement de l'ordre de 1,3, c'est-à-dire que les
réactions impliquant un
2 H fixé à l'un des atomes réagissant sont typiquement
environ 30% plus lentes que les réactions correspondantes impliquant
1 H.
La grandeur de ces effets isotopiques secondaires les rend plus difficiles à mesurer
que les effets primaires, et probablement pour cette raison, ils ont été assez peu
utilisés en enzymologie. Ils peuvent cependant fournir des informations mécaniques utiles, difficilement accessibles par d'autres mesures. De nombreux mécanismes proposés à la fois pour des réactions chimiques ordinaires et pour des
réactions catalysées par des enzymes, impliquent un changement de coordination
du carbone (comme par exemple le passage d'un état tétraédrique à un état trigonal)
quand l'état de transition est formé, et ce changement peut être détecté comme un
effet isotopique secondaire par la substitution isotopique d'un atome d'hydrogène
fixé à l'atome de carbone qui est impliqué dans la réaction, même si la liaison
C – H, responsable de l'effet isotopique n'est pas modifiée par la réaction. Ce type
d'approche a été utilisé, par exemple, dans l'étude de la β-galactosidase (SINNOTT
et SOUCHARD, 1973).
7.6.3. Effets isotopiques sur les équilibres
Essentiellement les mêmes arguments s'appliquent aux effets isotopiques sur les
équilibres qu'aux effets isotopiques secondaires : les effets de substitutions isotopiques sur les niveaux d'énergie s'opèrent dans des directions opposées sur les