6 – RÉACTIONS À PLUSIEURS SUBSTRATS
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de sorte que deux molécules de substrats peuvent se fixer pour former un complexe
ternaire à partir duquel un premier produit est libéré avant que le troisième substrat
ne puisse se fixer. Par exemple, avec la plupart des aminoacyl-ARNt synthétases,
l'acide aminé et l'ATP réagissent avec l'enzyme pour libérer du pyrophosphate et
former un complexe ternaire composé de l'enzyme, de l'acide aminé et de l'AMP ;
ce complexe réagit alors avec l'ARNt pour terminer la réaction. Dans le cas de la
thréonyl-ARNt synthétase, l'isolement d'un tel complexe (ALLENDE J.E. et al.,
1964) a permis de réaliser une analyse cinétique qui a confirmé l'interprétation
initiale (ALLENDE C.C. et al., 1970). Depuis lors, de nombreuses études similaires
ont été réalisées avec d'autres enzymes du même groupe.
Il est clair que le nombre de mécanismes possibles est très grand, et même si
certains peuvent être exclus parce qu'ils ne sont pas plausibles chimiquement (une
élimination qui n'est pas toujours faite) il reste encore environ dix huit mécanismes
possibles à trois substrats et trois produits (dont la liste à été établie par WONG et
HANES, 1969) sans considérer les complications possibles de formation de complexes non-productifs et d'isomérisation. Il est donc particulièrement important de
prendre en compte la plausibilité chimique des mécanismes dans l'étude cinétique
des réactions à trois substrats. De plus, à condition que la vitesse semble obéir à
l'équation de MICHAELIS et MENTEN pour chacun des substrats considérés séparément, la pratique habituelle consiste à utiliser des équations de vitesse dérivées en
supposant que toutes les parties aléatoires du mécanisme sont dans un état de
quasi-équilibre et que toutes les parties ordonnées sont à l'état stationnaire. Ceci
empêche évidemment l'apparition de termes d'ordre élevé dans l'équation de vitesse
et fournit un argument pour l'utilisation de la méthode de CHA (§ 6.3.6).
D'un point de vue cinétique, les différents types de mécanisme génèrent des équations de vitesse comparables à l'équation [6.58] mais qui différent entre elles par
l'absence de certains termes au dénominateur, comme l'a fait remarquer en premier
FRIEDEN (1959). Par exemple, pour le mécanisme illustré dans la figure 6.21 il est
évident que la constante et les termes en [] A et [] B sont absents du dénominateur de l'équation de vitesse (parce qu'il est impossible de trouver un profil de
KING et ALTMAN qui ne contienne aucun terme de concentration ou qui contienne
uniquement [] A ou uniquement [] B : voir § 6.3.6). Ainsi l'équation de vitesse
pour ce mécanisme s'écrit comme suit :
v
VA B C
KC
K
A BK
A C
K
B C
A B C
AB
mC
mB
mA
=
++++
1 [] [] []
[]
[] []
[] []
[] [][] [] []
[6.59]
Pour n'importe quelle concentration de substrat variable et dans des conditions où
la concentration des deux autres substrats est maintenue constante, cette équation a
la forme d'une équation de MICHAELIS et MENTEN, avec des constantes apparentes
qui sont présentées dans le tableau 6.5. Comme d'habitude, le comportement de
K m
app est trop complexe pour être utilisé directement, mais celui des deux autres
paramètres est très informatif.
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de sorte que deux molécules de substrats peuvent se fixer pour former un complexe
ternaire à partir duquel un premier produit est libéré avant que le troisième substrat
ne puisse se fixer. Par exemple, avec la plupart des aminoacyl-ARNt synthétases,
l'acide aminé et l'ATP réagissent avec l'enzyme pour libérer du pyrophosphate et
former un complexe ternaire composé de l'enzyme, de l'acide aminé et de l'AMP ;
ce complexe réagit alors avec l'ARNt pour terminer la réaction. Dans le cas de la
thréonyl-ARNt synthétase, l'isolement d'un tel complexe (ALLENDE J.E. et al.,
1964) a permis de réaliser une analyse cinétique qui a confirmé l'interprétation
initiale (ALLENDE C.C. et al., 1970). Depuis lors, de nombreuses études similaires
ont été réalisées avec d'autres enzymes du même groupe.
Il est clair que le nombre de mécanismes possibles est très grand, et même si
certains peuvent être exclus parce qu'ils ne sont pas plausibles chimiquement (une
élimination qui n'est pas toujours faite) il reste encore environ dix huit mécanismes
possibles à trois substrats et trois produits (dont la liste à été établie par WONG et
HANES, 1969) sans considérer les complications possibles de formation de complexes non-productifs et d'isomérisation. Il est donc particulièrement important de
prendre en compte la plausibilité chimique des mécanismes dans l'étude cinétique
des réactions à trois substrats. De plus, à condition que la vitesse semble obéir à
l'équation de MICHAELIS et MENTEN pour chacun des substrats considérés séparément, la pratique habituelle consiste à utiliser des équations de vitesse dérivées en
supposant que toutes les parties aléatoires du mécanisme sont dans un état de
quasi-équilibre et que toutes les parties ordonnées sont à l'état stationnaire. Ceci
empêche évidemment l'apparition de termes d'ordre élevé dans l'équation de vitesse
et fournit un argument pour l'utilisation de la méthode de CHA (§ 6.3.6).
D'un point de vue cinétique, les différents types de mécanisme génèrent des équations de vitesse comparables à l'équation [6.58] mais qui différent entre elles par
l'absence de certains termes au dénominateur, comme l'a fait remarquer en premier
FRIEDEN (1959). Par exemple, pour le mécanisme illustré dans la figure 6.21 il est
évident que la constante et les termes en [] A et [] B sont absents du dénominateur de l'équation de vitesse (parce qu'il est impossible de trouver un profil de
KING et ALTMAN qui ne contienne aucun terme de concentration ou qui contienne
uniquement [] A ou uniquement [] B : voir § 6.3.6). Ainsi l'équation de vitesse
pour ce mécanisme s'écrit comme suit :
v
VA B C
KC
K
A BK
A C
K
B C
A B C
AB
mC
mB
mA
=
++++
1 [] [] []
[]
[] []
[] []
[] [][] [] []
[6.59]
Pour n'importe quelle concentration de substrat variable et dans des conditions où
la concentration des deux autres substrats est maintenue constante, cette équation a
la forme d'une équation de MICHAELIS et MENTEN, avec des constantes apparentes
qui sont présentées dans le tableau 6.5. Comme d'habitude, le comportement de
K m
app est trop complexe pour être utilisé directement, mais celui des deux autres
paramètres est très informatif.