6 – RÉACTIONS À PLUSIEURS SUBSTRATS
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substrats de ces deux enzymes doivent être utilisés à des concentrations finales de
l'ordre de 1 mM pour le phosphoénolpyruvate et de 0,3 mM pour le NAD red . Le
système couplé ne doit pas limiter la vitesse de l'ensemble du système. L'ADP doit
être converti en ATP aussitôt qu'il est produit et ne doit donc pas s'accumuler. Il en
va de même pour le NAD red qui doit être consommé simultanément à la production
d'ATP. De plus la réaction doit être suffisamment rapide pour permettre une
mesure aisée de la vitesse initiale. Il faut donc vérifier l'efficacité du système
couplé et déterminer sa vitesse afin de choisir la quantité adéquate d'enzyme. La
concentration de créatine kinase doit être aussi élevée que possible dans les limites
de saturation du système couplé. Il faut que la vitesse de disparition du NAD red soit
proportionnelle à la quantité de créatine kinase présente dans le mélange
réactionnel.
Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprétables, il est nécessaire mesurer la vitesse initiale de la réaction directe pour des concentrations de
créatine allant de 1 à 20 mM pour différentes concentrations d'ATP allant de 1,5 à
12 mM. Les mesures de vitesse sont toutes effectuées à 25°C, dans un tampon
50 mM Tris/HCl à pH 7,1 contenant 5 mM d'acétate de magnésium (le Mg
2+ est
nécessaire au fonctionnement de la créatine kinase, car les substrats de l'enzyme
sont les complexes MgATP et MgADP (voir § 4.4)), 0,5 mM de dithiothreitol (qui
permet la réduction de la fonction thiol dans le site actif de la créatine kinase) et
0,5 mM d'EGTA (un agent chélateur des métaux lourds, en particulier du Zn
2+ , qui
sont des inhibiteurs de l'enzyme).
Pour étudier la réaction inverse, il est nécessaire d'utiliser un second système
couplé. Dans ce cas, l'ATP produit par la créatine kinase est utilisé, d'abord par
l'hexokinase. En présence de glucose, cet enzyme convertit l'ATP en ADP et transforme le glucose en glucose 6-phosphate. Le glucose 6-phosphate est alors utilisé
par un second enzyme, la glucose 6-phosphate déshydrogénase qui l'oxyde en
6-phosphogluconate tout en réduisant le NAD ox en NAD red . Ce second système a
l'avantage d'utiliser le même signal spectroscopique que le premier. L'utilisation de
ce système nécessite les mêmes mises au point que celles décrites pour le système
pyruvate kinase/lactate déshydrogénase. Pour obtenir des graphiques primaires et
secondaires interprétables, il est nécessaire de mesurer la vitesse initiale de la
réaction directe pour des concentrations de phosphocréatine, allant de 0,25 à
5,0 mM pour différentes concentrations d'ADP allant de 0,05 à 1,0 mM.
6.10. Réactions à trois substrats et plus
Les méthodes pour l'étude des réactions impliquant plus de deux substrats sont une
extension logique de celles décrites dans les paragraphes précédents ; elles ne
nécessitent donc pas une présentation aussi détaillée que celle faite pour les
réactions à deux substrats. Les réactions de ce type ne sont ni rares, ni négligeables
en biochimie − elles comprennent par exemple le groupe des réactions catalysées
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substrats de ces deux enzymes doivent être utilisés à des concentrations finales de
l'ordre de 1 mM pour le phosphoénolpyruvate et de 0,3 mM pour le NAD red . Le
système couplé ne doit pas limiter la vitesse de l'ensemble du système. L'ADP doit
être converti en ATP aussitôt qu'il est produit et ne doit donc pas s'accumuler. Il en
va de même pour le NAD red qui doit être consommé simultanément à la production
d'ATP. De plus la réaction doit être suffisamment rapide pour permettre une
mesure aisée de la vitesse initiale. Il faut donc vérifier l'efficacité du système
couplé et déterminer sa vitesse afin de choisir la quantité adéquate d'enzyme. La
concentration de créatine kinase doit être aussi élevée que possible dans les limites
de saturation du système couplé. Il faut que la vitesse de disparition du NAD red soit
proportionnelle à la quantité de créatine kinase présente dans le mélange
réactionnel.
Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprétables, il est nécessaire mesurer la vitesse initiale de la réaction directe pour des concentrations de
créatine allant de 1 à 20 mM pour différentes concentrations d'ATP allant de 1,5 à
12 mM. Les mesures de vitesse sont toutes effectuées à 25°C, dans un tampon
50 mM Tris/HCl à pH 7,1 contenant 5 mM d'acétate de magnésium (le Mg
2+ est
nécessaire au fonctionnement de la créatine kinase, car les substrats de l'enzyme
sont les complexes MgATP et MgADP (voir § 4.4)), 0,5 mM de dithiothreitol (qui
permet la réduction de la fonction thiol dans le site actif de la créatine kinase) et
0,5 mM d'EGTA (un agent chélateur des métaux lourds, en particulier du Zn
2+ , qui
sont des inhibiteurs de l'enzyme).
Pour étudier la réaction inverse, il est nécessaire d'utiliser un second système
couplé. Dans ce cas, l'ATP produit par la créatine kinase est utilisé, d'abord par
l'hexokinase. En présence de glucose, cet enzyme convertit l'ATP en ADP et transforme le glucose en glucose 6-phosphate. Le glucose 6-phosphate est alors utilisé
par un second enzyme, la glucose 6-phosphate déshydrogénase qui l'oxyde en
6-phosphogluconate tout en réduisant le NAD ox en NAD red . Ce second système a
l'avantage d'utiliser le même signal spectroscopique que le premier. L'utilisation de
ce système nécessite les mêmes mises au point que celles décrites pour le système
pyruvate kinase/lactate déshydrogénase. Pour obtenir des graphiques primaires et
secondaires interprétables, il est nécessaire de mesurer la vitesse initiale de la
réaction directe pour des concentrations de phosphocréatine, allant de 0,25 à
5,0 mM pour différentes concentrations d'ADP allant de 0,05 à 1,0 mM.
6.10. Réactions à trois substrats et plus
Les méthodes pour l'étude des réactions impliquant plus de deux substrats sont une
extension logique de celles décrites dans les paragraphes précédents ; elles ne
nécessitent donc pas une présentation aussi détaillée que celle faite pour les
réactions à deux substrats. Les réactions de ce type ne sont ni rares, ni négligeables
en biochimie − elles comprennent par exemple le groupe des réactions catalysées