Chapitre II : Matériels et Méthodes
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L’activité protéolytique A est exprimée par U unités de tyrosine libérées lors de
l’hydrolyse enzymatique de la caséine par 1 mL de surnageant. Elle est calculée selon la
formule suivante :
Avec :
T : le temps d’incubation au bain marie (10 min),
P : c’est la pente de la courbe d’étalonnage de la tyrosine, P=0,0055
D : dilution initiale de l’enzyme (5, 10, etc.),
D : dilution de l’enzyme dans le milieu réactionnel, D= 4,5/1,5
AE : Absorbance moyenne des deux repliquats des surnageants,
AT : Absorbance du témoin.
II.2.5.2. Évaluation de la croissance de la bactérie
En parallèle avec la mesure quantitative de l’activité protéolytique, une évaluation de la
croissance de la bactérie performante dans les différents milieux a été effectuée par
dénombrement sur milieu solide.
La technique se résume comme suit :
A la fin des expériences, la croissance bactérienne dans les différents milieux, à base de la
poudre de crevette, a été évaluée par la méthode de dénombrement des colonies bactériennes. A
l’aide d’une micropipette portant des embouts stériles et devant le bec bunsen, on prélève 1 mL
de chaque culture que l’on ajoute à 9 mL de l’eau physiologique (NaCl à 9 g/L) dans des tubes ;
soit la dilution 10
-1
. A partir de cette dilution, on ajoute 1 mL à 9 mL de l’eau physiologique (en
utilisant un autre embout stérile) ; soit la dilution 10
-2 . On continue à diluer les cultures de la
même façon jusqu’à atteindre la dilution souhaitée (cela dépend de la charge bactérienne initiale
estimée). A chaque étape, on homogénéise le contenu des tubes après introduction de l’inoculum
par agitation douce dans le vortex (d’environ 5 secondes). Par la suite, 0,2 mL de la suspension
bactérienne contenue dans chaque tube est étalée sur la totalité de la surface des boites de Pétri
(deux boites de Pétri par dilution) contenant un milieu LB solide (Figure II.4).
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L’activité protéolytique A est exprimée par U unités de tyrosine libérées lors de
l’hydrolyse enzymatique de la caséine par 1 mL de surnageant. Elle est calculée selon la
formule suivante :
Avec :
T : le temps d’incubation au bain marie (10 min),
P : c’est la pente de la courbe d’étalonnage de la tyrosine, P=0,0055
D : dilution initiale de l’enzyme (5, 10, etc.),
D : dilution de l’enzyme dans le milieu réactionnel, D= 4,5/1,5
AE : Absorbance moyenne des deux repliquats des surnageants,
AT : Absorbance du témoin.
II.2.5.2. Évaluation de la croissance de la bactérie
En parallèle avec la mesure quantitative de l’activité protéolytique, une évaluation de la
croissance de la bactérie performante dans les différents milieux a été effectuée par
dénombrement sur milieu solide.
La technique se résume comme suit :
A la fin des expériences, la croissance bactérienne dans les différents milieux, à base de la
poudre de crevette, a été évaluée par la méthode de dénombrement des colonies bactériennes. A
l’aide d’une micropipette portant des embouts stériles et devant le bec bunsen, on prélève 1 mL
de chaque culture que l’on ajoute à 9 mL de l’eau physiologique (NaCl à 9 g/L) dans des tubes ;
soit la dilution 10
-1
. A partir de cette dilution, on ajoute 1 mL à 9 mL de l’eau physiologique (en
utilisant un autre embout stérile) ; soit la dilution 10
-2 . On continue à diluer les cultures de la
même façon jusqu’à atteindre la dilution souhaitée (cela dépend de la charge bactérienne initiale
estimée). A chaque étape, on homogénéise le contenu des tubes après introduction de l’inoculum
par agitation douce dans le vortex (d’environ 5 secondes). Par la suite, 0,2 mL de la suspension
bactérienne contenue dans chaque tube est étalée sur la totalité de la surface des boites de Pétri
(deux boites de Pétri par dilution) contenant un milieu LB solide (Figure II.4).