Chapitre II : Matériels et Méthodes
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II.2.5. Méthodes analytiques
II.2.5.1. Dosage de l’activité protéolytique :
L’activité protéolytique, plus précisément l’activité caséinolytique, est mesurée dans le surnagent
des milieux (M1, M2, M3, H1, H2 et H3) selon le protocole suivant :
1- Préparation du tampon (T) :
Une solution de tris de 50 mmole/L est préparée en ajoutant exactement 6,06 g de trisbase à 1 L d’eau distillée. Le pH de la solution est ajusté à 9 avec une solution concentrée
de HCl.
2- Préparation de substrat Caséine (C) :
Une solution de 0,2 g de caséine est préparée dans 20 mL de la solution de tampon. La
caséine est peu soluble dans l’eau, un chauffage à une température à 80 °C (dans
l’agitateur magnétique) pendant une durée pas moins de 15 min est indispensable pour
une solubilisation maximale du substrat.
3- Préparation de l’enzyme dilué (ED) :
Plusieurs dilutions des surnageant, basée sur la concentration de l’enzyme, sont
effectuées. Les dilutions sélectionnées sont 5, 10, 20, 50 et 100. Elles sont préparées dans
la solution de tampon. A titre d’exemple, pour la dilution de 5 fois, on prend 1 mL de
surnageant et on complète à 5 mL avec la solution du tampon. Pour la dilution 20, on
prend 0,2 mL (à l’aide d’une micropipette) on complète à 10 mL avec le tampon. Chaque
dilution est préparée en duplicatas. (Annexe I-figure 7)
4- Protocole de la réaction enzymatique :
Ce protocole consiste à mélanger, à l’aide d’une macropipette, 1,5 mL du tampon, 1,5
mL de l’enzyme dilué et 1,5 mL de la caséine dans des tubes a essaie. Les tubes sont
incubés au bain-marie à 60 °C pendent 10 min (conditions optimales de l’activité de cette
enzyme). La réaction enzymatique est arrêtée rapidement par ajout de 1,5 mL d’une
solution d’acide trichloracétique (TCA) d’une concentration de 100 g/L. Les tubes sont
bien mélangés puis incubés à température ambiante pendant 15 min (Annexe I-figure 8).
Les mélanges résultants sont centrifugés (à 6000 tr/min pendant 20 min) et filtrés pour
récupérer les surnageants. L’activité protéolytique des surnageants est déterminée par
spectrophotométrie à une longueur d’onde de 280 nm.
Un témoin de la réaction enzymatique est préparé de la même manière que les
échantillons sauf que le surnageant de culture est ajouté après addition du TCA.
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II.2.5. Méthodes analytiques
II.2.5.1. Dosage de l’activité protéolytique :
L’activité protéolytique, plus précisément l’activité caséinolytique, est mesurée dans le surnagent
des milieux (M1, M2, M3, H1, H2 et H3) selon le protocole suivant :
1- Préparation du tampon (T) :
Une solution de tris de 50 mmole/L est préparée en ajoutant exactement 6,06 g de trisbase à 1 L d’eau distillée. Le pH de la solution est ajusté à 9 avec une solution concentrée
de HCl.
2- Préparation de substrat Caséine (C) :
Une solution de 0,2 g de caséine est préparée dans 20 mL de la solution de tampon. La
caséine est peu soluble dans l’eau, un chauffage à une température à 80 °C (dans
l’agitateur magnétique) pendant une durée pas moins de 15 min est indispensable pour
une solubilisation maximale du substrat.
3- Préparation de l’enzyme dilué (ED) :
Plusieurs dilutions des surnageant, basée sur la concentration de l’enzyme, sont
effectuées. Les dilutions sélectionnées sont 5, 10, 20, 50 et 100. Elles sont préparées dans
la solution de tampon. A titre d’exemple, pour la dilution de 5 fois, on prend 1 mL de
surnageant et on complète à 5 mL avec la solution du tampon. Pour la dilution 20, on
prend 0,2 mL (à l’aide d’une micropipette) on complète à 10 mL avec le tampon. Chaque
dilution est préparée en duplicatas. (Annexe I-figure 7)
4- Protocole de la réaction enzymatique :
Ce protocole consiste à mélanger, à l’aide d’une macropipette, 1,5 mL du tampon, 1,5
mL de l’enzyme dilué et 1,5 mL de la caséine dans des tubes a essaie. Les tubes sont
incubés au bain-marie à 60 °C pendent 10 min (conditions optimales de l’activité de cette
enzyme). La réaction enzymatique est arrêtée rapidement par ajout de 1,5 mL d’une
solution d’acide trichloracétique (TCA) d’une concentration de 100 g/L. Les tubes sont
bien mélangés puis incubés à température ambiante pendant 15 min (Annexe I-figure 8).
Les mélanges résultants sont centrifugés (à 6000 tr/min pendant 20 min) et filtrés pour
récupérer les surnageants. L’activité protéolytique des surnageants est déterminée par
spectrophotométrie à une longueur d’onde de 280 nm.
Un témoin de la réaction enzymatique est préparé de la même manière que les
échantillons sauf que le surnageant de culture est ajouté après addition du TCA.