Chapitre II : Matériels et Méthodes
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Figure II- 1 : Les milieux de production brute
II.2.4.2. Hydrolyse enzymatique
Dans la deuxième technique, l’hydrolyse enzymatique se fait en deux étapes : la production de la
protéase dans des milieux plus favorable, qui contiennent des substrats plus assimilables
(caséine, poudre de lait), et l’hydrolyse enzymatique proprement dit (méthode pH-Stat).
II.2.4.2.1. Préparation de l’extrait enzymatique
La souche bactérienne performante produit un maximum de protéase dans un milieu optimal
(H1, sa composition a été optimisée antérieurement par une doctorante du laboratoire LCSNBioM). 2,5 mL d’inoculum a été ajouté à 100 mL de ce milieu. La cinétique de production a été
suivie pendant 3 jours. La culture a été ensuite centrifugée (à 6000 tr/min pendant 20 min), le
surnageant a été récupéré, utilisé immédiatement ou stocké à -18 °C jusqu’à son utilisation dans
l’étape d’hydrolyse (pour une période qui ne dépasse pas une semaine).
Les protéases d’autres milieux (H2, H3, et H4) ont été aussi extraites pour les utiliser dans
l’hydrolyse enzymatique.
II.2.4.2.2. Hydrolyse enzymatique via la méthode pH-Stat
Dans un erlenmeyer de 250 mL, 40 g de PDC a été mélangée avec 60 mL de solution tampon de
Tris-HCl (sa préparation est mise dans II.2.5.1) et 60 mL d’extrait enzymatique puis mis à
l’agitateur magnétique chauffant (Figure II.2) pendant 2h avec un pH 9 et une température de 60
°C (facteurs optimales de la réaction enzymatique). Pour maintenir un pH constant, on ajout
quelques gouttes d’une solution de NaOH (1 mol/L) dès que le pH mètre affiche une petite
déviation de la valeur 9 (pas plus de 0.1 unité) (Djellouli, 2018). Le volume de la soude
consommée permet de calculer le degré d’hydrolyse.
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Figure II- 1 : Les milieux de production brute
II.2.4.2. Hydrolyse enzymatique
Dans la deuxième technique, l’hydrolyse enzymatique se fait en deux étapes : la production de la
protéase dans des milieux plus favorable, qui contiennent des substrats plus assimilables
(caséine, poudre de lait), et l’hydrolyse enzymatique proprement dit (méthode pH-Stat).
II.2.4.2.1. Préparation de l’extrait enzymatique
La souche bactérienne performante produit un maximum de protéase dans un milieu optimal
(H1, sa composition a été optimisée antérieurement par une doctorante du laboratoire LCSNBioM). 2,5 mL d’inoculum a été ajouté à 100 mL de ce milieu. La cinétique de production a été
suivie pendant 3 jours. La culture a été ensuite centrifugée (à 6000 tr/min pendant 20 min), le
surnageant a été récupéré, utilisé immédiatement ou stocké à -18 °C jusqu’à son utilisation dans
l’étape d’hydrolyse (pour une période qui ne dépasse pas une semaine).
Les protéases d’autres milieux (H2, H3, et H4) ont été aussi extraites pour les utiliser dans
l’hydrolyse enzymatique.
II.2.4.2.2. Hydrolyse enzymatique via la méthode pH-Stat
Dans un erlenmeyer de 250 mL, 40 g de PDC a été mélangée avec 60 mL de solution tampon de
Tris-HCl (sa préparation est mise dans II.2.5.1) et 60 mL d’extrait enzymatique puis mis à
l’agitateur magnétique chauffant (Figure II.2) pendant 2h avec un pH 9 et une température de 60
°C (facteurs optimales de la réaction enzymatique). Pour maintenir un pH constant, on ajout
quelques gouttes d’une solution de NaOH (1 mol/L) dès que le pH mètre affiche une petite
déviation de la valeur 9 (pas plus de 0.1 unité) (Djellouli, 2018). Le volume de la soude
consommée permet de calculer le degré d’hydrolyse.