Chapitre II : Matériels et Méthodes
22
H3 : 15 g PDC, 5 g de caséine ; 0,5 g K 2 HPO 4 dans 1 L d’eau distillée. Le pH du milieu est
ajusté à 7±0,4 avec une solution de l’acide chlorhydrique (1 mol/L). Le milieu est stérilisé à
l’autoclave à 121 °C pendant 20 min.
Mt : 15 g PDC dans 1 L d’eau distillée. Le pH du milieu est ajusté à 7,4 avec une solution
de l’acide chlorhydrique (1 mol/L). Le milieu est stérilisé à l’autoclave à 121 °C pendant 20
min. Ce milieu a été utilisé comme milieu témoin sans inoculation avec la souche S14.
100 mL de chaque milieu est préparé dans erlenmeyers de 500 mL, auxquels on ajoute 2 à 5 %
(v/v) de préculture des souches bactériennes (préparées selon II.2.3). Les cultures ont incubés à
37 °C et une agitation de 150 tr/min dans un incubateur agitateur.
II.2. Méthodes
II.2.1. Conservation et vérification de la pureté des souches
A partir des cultures anciennes des souches bactériennes (ramenées du laboratoire LCSN-BioM,
Université Blida 1), on prend un fragment de colonies, devant un bec bunsen, et on fait un
repiquage par stries ou par quadrant dans des boites de pétri contenant du milieu LB solide. Les
boites sont incubées à 37°C pendant 24-48 h. Après développement bactérien, les boites sont
conservées à +4°C pendant une à deux semaines (conservation à courte terme). La purification
des souches est vérifiée par la présence d’une seule forme de colonies et par observation
microscopique (forme unique bacille des cellules). Pour cela, un fragment de colonies est déposé
sur une lame mouillée avec quelques gouttes d’eau physiologique stérile, ensuite recouvrée par
la lamelle. La visualisation au microscope est maintenue à un agrandissement de 400 fois ( état
frais).
Pour une conservation à moyenne terme, des tubes contenant le milieu LB solide incliné sont
ensemencés en stries par les souches bactériennes, puis incubés à 37°C jusqu’au développement
des stries des bactéries (48 h), puis conservés à +4 °C.
II.2.2. Criblage préliminaire de l’activité protéolytique
Pour sélectionner la souche la plus performante, les boîtes de pétri contenant le milieu GNL sont
ensemencées en point central avec les souches bactériennes S13 et S14, puis incubées à 37°C
pendant 24-48h (Allala, 2021). L’activité protéolytique des souches bactériennes se distinguent
par l’apparition d’un halo translucide autour de la piqure, qui traduit la production de l’enzyme
caséinase (qui hydrolyse la caséine du lait).
Plus le diamètre du halo est grand, plus la souche est performante dans la production de protéase
extracellulaire.
22
H3 : 15 g PDC, 5 g de caséine ; 0,5 g K 2 HPO 4 dans 1 L d’eau distillée. Le pH du milieu est
ajusté à 7±0,4 avec une solution de l’acide chlorhydrique (1 mol/L). Le milieu est stérilisé à
l’autoclave à 121 °C pendant 20 min.
Mt : 15 g PDC dans 1 L d’eau distillée. Le pH du milieu est ajusté à 7,4 avec une solution
de l’acide chlorhydrique (1 mol/L). Le milieu est stérilisé à l’autoclave à 121 °C pendant 20
min. Ce milieu a été utilisé comme milieu témoin sans inoculation avec la souche S14.
100 mL de chaque milieu est préparé dans erlenmeyers de 500 mL, auxquels on ajoute 2 à 5 %
(v/v) de préculture des souches bactériennes (préparées selon II.2.3). Les cultures ont incubés à
37 °C et une agitation de 150 tr/min dans un incubateur agitateur.
II.2. Méthodes
II.2.1. Conservation et vérification de la pureté des souches
A partir des cultures anciennes des souches bactériennes (ramenées du laboratoire LCSN-BioM,
Université Blida 1), on prend un fragment de colonies, devant un bec bunsen, et on fait un
repiquage par stries ou par quadrant dans des boites de pétri contenant du milieu LB solide. Les
boites sont incubées à 37°C pendant 24-48 h. Après développement bactérien, les boites sont
conservées à +4°C pendant une à deux semaines (conservation à courte terme). La purification
des souches est vérifiée par la présence d’une seule forme de colonies et par observation
microscopique (forme unique bacille des cellules). Pour cela, un fragment de colonies est déposé
sur une lame mouillée avec quelques gouttes d’eau physiologique stérile, ensuite recouvrée par
la lamelle. La visualisation au microscope est maintenue à un agrandissement de 400 fois ( état
frais).
Pour une conservation à moyenne terme, des tubes contenant le milieu LB solide incliné sont
ensemencés en stries par les souches bactériennes, puis incubés à 37°C jusqu’au développement
des stries des bactéries (48 h), puis conservés à +4 °C.
II.2.2. Criblage préliminaire de l’activité protéolytique
Pour sélectionner la souche la plus performante, les boîtes de pétri contenant le milieu GNL sont
ensemencées en point central avec les souches bactériennes S13 et S14, puis incubées à 37°C
pendant 24-48h (Allala, 2021). L’activité protéolytique des souches bactériennes se distinguent
par l’apparition d’un halo translucide autour de la piqure, qui traduit la production de l’enzyme
caséinase (qui hydrolyse la caséine du lait).
Plus le diamètre du halo est grand, plus la souche est performante dans la production de protéase
extracellulaire.