III.1.3.2. Les facteurs influençant l’EAM ……………………………………………..
73
III.2. L’extraction par ultrasons ………………………………………………………..
74
III.2.1. Les ultrasons …………………………………………………………………...
74
III.2.2. Propagation des ondes ultrasons et formation des bulles de cavitation ……….. 75
III.2.3. L’extraction assistée par ultrasons (EAU) ……………………………… 76
III.2.4. Appareillage pour l’extraction EAU …………………………………………..
77
III.2.5. Les facteurs influençant l’EAU ………………………………………………..
78
Partie II: matériels et méthodes
I.
Matériel biologique..…………………………………………..
82
I.1.Récolte du matériel biologique …………………………………………………….
82
I.2. Localisation de station d’échantillonnage …………………………………………
82
II.
Extraction des substances actives ……………………………
84
II.1. Traitement des échantillons, dissection et extraction …………………………….
84
II.2. Procédures d’extraction …………………………………………………………..
87
II.2.1. Extraction assistée par micro-ondes (EAM) ……………………………………
87
II.2.2. Extraction assistée par ultrasons (EAU) ………………………………………..
88
II.2.3. Extraction conventionnelle (EC) ……………………………………………….
88
II.3. Conception de travaux expérimentaux et modélisation statistique ……………….
89
II.3.1. Étude préliminaire ………………………………………………………………
89
II.3.2. Application de plan d’expérience pour l’optimisation de l’extraction …………
93
II.3.3. Analyse statistique des données ………………………………………………...
97
II.4. Purification des extraits …………………………………………………………..
97
II.4.1. Isolement des saponines ………………………………………………………...
98
II.4.1.1. Estimation de la teneur totale des saponines …………………………………
99
a. Étude quantitative des saponines d’E.sepositus ………………………………. 100
II.4. 2. Isolement des caroténoïdes ……………………………………………………. 100
II.4.2.1. Estimation de la teneur totale des caroténoïdes ……………………………… 101
II.4.3. Estimation de rendement total d’extraction ……………………………………. 101
III. Activité biologique ……………………………………………. 104
III.1. Activité anti-oxydante …………………………………………………………... 104
III.1.1. Effet scavenger du radical DPPH
…………………………………………….. 104
III.1.2. Effet scavenger de l’anion superoxyde O2
•…………………………………… 105
III.1.3. Capacité de réduction de l’hémolyse oxydatif par les saponines ……………... 108
III.1.3.1.Détermination des concentrations non hémolytique des saponines …………. 109
III.1.3.2. Évaluation de l’activité anti-hémolytique des saponines …………………... 110
IV. Identification structurelle des saponines d’Echinaster
sepositus ……………………………………………………….. 111
IV.1. La spectrométrie de masse ……………………………………………………… 111
IV.2. La Résonance Magnétique Nucléaire RMN ……………………………………...…. 112
73
III.2. L’extraction par ultrasons ………………………………………………………..
74
III.2.1. Les ultrasons …………………………………………………………………...
74
III.2.2. Propagation des ondes ultrasons et formation des bulles de cavitation ……….. 75
III.2.3. L’extraction assistée par ultrasons (EAU) ……………………………… 76
III.2.4. Appareillage pour l’extraction EAU …………………………………………..
77
III.2.5. Les facteurs influençant l’EAU ………………………………………………..
78
Partie II: matériels et méthodes
I.
Matériel biologique..…………………………………………..
82
I.1.Récolte du matériel biologique …………………………………………………….
82
I.2. Localisation de station d’échantillonnage …………………………………………
82
II.
Extraction des substances actives ……………………………
84
II.1. Traitement des échantillons, dissection et extraction …………………………….
84
II.2. Procédures d’extraction …………………………………………………………..
87
II.2.1. Extraction assistée par micro-ondes (EAM) ……………………………………
87
II.2.2. Extraction assistée par ultrasons (EAU) ………………………………………..
88
II.2.3. Extraction conventionnelle (EC) ……………………………………………….
88
II.3. Conception de travaux expérimentaux et modélisation statistique ……………….
89
II.3.1. Étude préliminaire ………………………………………………………………
89
II.3.2. Application de plan d’expérience pour l’optimisation de l’extraction …………
93
II.3.3. Analyse statistique des données ………………………………………………...
97
II.4. Purification des extraits …………………………………………………………..
97
II.4.1. Isolement des saponines ………………………………………………………...
98
II.4.1.1. Estimation de la teneur totale des saponines …………………………………
99
a. Étude quantitative des saponines d’E.sepositus ………………………………. 100
II.4. 2. Isolement des caroténoïdes ……………………………………………………. 100
II.4.2.1. Estimation de la teneur totale des caroténoïdes ……………………………… 101
II.4.3. Estimation de rendement total d’extraction ……………………………………. 101
III. Activité biologique ……………………………………………. 104
III.1. Activité anti-oxydante …………………………………………………………... 104
III.1.1. Effet scavenger du radical DPPH
…………………………………………….. 104
III.1.2. Effet scavenger de l’anion superoxyde O2
•…………………………………… 105
III.1.3. Capacité de réduction de l’hémolyse oxydatif par les saponines ……………... 108
III.1.3.1.Détermination des concentrations non hémolytique des saponines …………. 109
III.1.3.2. Évaluation de l’activité anti-hémolytique des saponines …………………... 110
IV. Identification structurelle des saponines d’Echinaster
sepositus ……………………………………………………….. 111
IV.1. La spectrométrie de masse ……………………………………………………… 111
IV.2. La Résonance Magnétique Nucléaire RMN ……………………………………...…. 112