Matériels et méthodes
Activités biologiques
110
Abs contrôle : c’est l’absorbance de la solution sens extrait de saponine, formée de la suspension
d’érythrocyte (500 µL) et de PBS (500 µL);
Abs d’hymolyse totale : c’est l’absorbance de la solution formée de la suspension d’érythrocyte
obtenue de contrôle négatif (500 µL) et de l’eau bi-distillée (500 µL);
La concentration de saponines requise pour lyser 50 % des érythrocytes (EC50%) et la
concentration non hémolytique ont été déterminées à partir de la courbe de pourcentage
d’hémolyse en fonction de concentration des saponines.
III.1.3.2. Évaluation de l’activité anti-hémolytique des saponines
Cette étape consiste à évaluer l’effet de concentration non hémolytique des saponines sur les
érythrocytes préalablement traités par l’initiateur des radicaux (Cu
+2 /H2O2).
Nous avons procédé comme suit pour évaluer cet effet:
Dans un premier temps, on procède au traitement des érythrocytes (500 μL) avec 500 μL de
saponines à la concentration non hémolytique (préparée dans de PBS). Puis on ajoute à ce
mélange 500μL de la solution d’initiateur de radicaux (formée de volume équivalent (v/v)
d’une solution de sulphate pentahydrate CuSO4, 5 H2O à 100 μM et de H2O2 à 30%).
L’ensemble est incubé à 37°C pendants 15 min, 30 min, 1 h, 2 h et 6 h avec une agitation
légère et continue. Après l’incubation le mélange est centrifugé à 1000 tr.min
-1 pendant 10
min et l’absorbance du surnageant est déterminée à 540 nm.
Dans cette étape le contrôle négatif est préparé avec (500 µL) d’érythrocyte et (500 µL) de
CuSO4 à 100μM;
En deuxième temps, les érythrocytes (500 μl) sont traités avec (500 μl) de la vitamine E à
différentes concentrations (0.5 μM à 2 mM) afin de déterminer la concentration non
protectrice de la vitamine E.
Dans cette étape le contrôle négatif est préparé avec (500 µL) d’érythrocyte et (500 µL) de
PBS (500 µL);
Dans un second temps, les érythrocytes (500 μl) sont traités simultanément avec la vitamine
E à la concentration non protectrice (0.25 μM) et les saponines à la concentration non
hémolytique avant d’ajouter la solution d’initiateur des radicaux (500 μl), afin de potentialiser
l’effet protecteur des saponines étudiées contre l’hémolyse oxydative.
Pour l’ensemble de ces expériences les conditions d’incubation et de centrifugation sont
identiques, et les pourcentages d’hémolyse sont calculés en utilisant l’équation 12.
Activités biologiques
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Abs contrôle : c’est l’absorbance de la solution sens extrait de saponine, formée de la suspension
d’érythrocyte (500 µL) et de PBS (500 µL);
Abs d’hymolyse totale : c’est l’absorbance de la solution formée de la suspension d’érythrocyte
obtenue de contrôle négatif (500 µL) et de l’eau bi-distillée (500 µL);
La concentration de saponines requise pour lyser 50 % des érythrocytes (EC50%) et la
concentration non hémolytique ont été déterminées à partir de la courbe de pourcentage
d’hémolyse en fonction de concentration des saponines.
III.1.3.2. Évaluation de l’activité anti-hémolytique des saponines
Cette étape consiste à évaluer l’effet de concentration non hémolytique des saponines sur les
érythrocytes préalablement traités par l’initiateur des radicaux (Cu
+2 /H2O2).
Nous avons procédé comme suit pour évaluer cet effet:
Dans un premier temps, on procède au traitement des érythrocytes (500 μL) avec 500 μL de
saponines à la concentration non hémolytique (préparée dans de PBS). Puis on ajoute à ce
mélange 500μL de la solution d’initiateur de radicaux (formée de volume équivalent (v/v)
d’une solution de sulphate pentahydrate CuSO4, 5 H2O à 100 μM et de H2O2 à 30%).
L’ensemble est incubé à 37°C pendants 15 min, 30 min, 1 h, 2 h et 6 h avec une agitation
légère et continue. Après l’incubation le mélange est centrifugé à 1000 tr.min
-1 pendant 10
min et l’absorbance du surnageant est déterminée à 540 nm.
Dans cette étape le contrôle négatif est préparé avec (500 µL) d’érythrocyte et (500 µL) de
CuSO4 à 100μM;
En deuxième temps, les érythrocytes (500 μl) sont traités avec (500 μl) de la vitamine E à
différentes concentrations (0.5 μM à 2 mM) afin de déterminer la concentration non
protectrice de la vitamine E.
Dans cette étape le contrôle négatif est préparé avec (500 µL) d’érythrocyte et (500 µL) de
PBS (500 µL);
Dans un second temps, les érythrocytes (500 μl) sont traités simultanément avec la vitamine
E à la concentration non protectrice (0.25 μM) et les saponines à la concentration non
hémolytique avant d’ajouter la solution d’initiateur des radicaux (500 μl), afin de potentialiser
l’effet protecteur des saponines étudiées contre l’hémolyse oxydative.
Pour l’ensemble de ces expériences les conditions d’incubation et de centrifugation sont
identiques, et les pourcentages d’hémolyse sont calculés en utilisant l’équation 12.